3. Регуляция процесса репликации.

• Регуляция репликации в основном происходит на этапе инициации.

• Место репликации строго определено, и эта область очень консервативна 245 п.о. 5 DnaА-боксов (сайты связывания с DnaА) по 9 п.о.; сайты вязывания ДНК-изгибающих белков (IHF, FIS); АТ богатый участок в левой части + 313 нуклеотидных повторов, начинается с GATC

• Инициация начинается с прикрепления DnaА

• Сверхпродукция DnaA - возрастание частот инициации без изменения скорости синтеза ДНК

• Зависит от скорости роста. В быстрорастущих - несколько вилок репликации (от одного oriC)

• Для повышения эффективности ДНК-полимеразы III есть β-кольца.

• У эукариот на инициацию влияют гистоны. Большое количество гистонов угнетает синтез ДНК (перед митозом) + влияет состав самого гистона. Много Arg - угнетание на 40%, много Lys - на 80%

4. Репликация эукариот.

Процесс почти такой же как у прокариот, но с рядом особенностей.

1. Ориджинов и вилок много

2. Скорость репликации у человека - 25п.о./с, у E.coli - 1000

3. Кольцо из бета-зажимов, не димер, а тример

4. Есть теломерные и центромерные участки

5. Есть гистоны, влияют их изоформы

6. ДНК не метилируется - иная система имунности (здесь метилирование - для изменения активности ДНК, и оно идет по цитозину). Пр: после оплодотворения в яйцеклетке идет установочное метилирование регуляторных участков, иначе синтез РНК погубит зародыш

У эукариот репликация проходит в S-фазе, одновременно образуется много репликонов. Рпеликация может идти в одну сторону или в обе. Репликоны могут сливаться и для избежания повторной репликации того же ориджина существует лицензирующий фактор - белок разрушающийся после акта репликации. Пока он не восстановится, репликации на том же ориджине не будет.

Инициация репликации

1. Ранняя G1 - сборка пререплекативного комплекса (ORC + Cdc6 + Cdt1 +Mcm(хеликаза) )

2. Комплекс Cdk/ClnA переводит клетку в S фазу и фосфорилирует пререплекативный комплекс (кроме ORC)

3. Cdc6 и Cdt1 отваливаются

4. ORC фосфорилируется (запрет на повторную сборку пререпл комплекса)

5. На ориджин садятся белки преинициаторного комплекса (Cdc45/Rpa) создают платформу для посадки реплисомы

6. Потом на новую цепь сядет еще один фосфорилированный ORC. Дефосфорилирование - в конце митоза

!Доп: Сестринские хроматиды сшиваются кольцом из когезинов, которое замыкается клейзином. В анафазе сепараза разрежет клейзин, и сестринские хроматиды могут разойтись.!

Процесс репликации

У эукариот другие полимеразы!

• ДНК-полимераза α (альфа) - обычно в комплексе с ДНК-праймазой, которая синтезирует РНК-затравки. Тетрамер. ТОЛЬКО этот комплекс способен к синтезу ДНК de novo. Синтезирует затравки и у лидирующей и у отстающей цепей. Обычно без 3’->5’ эндонуклеазной активности

• ДНК-полимераза β - самая маленькая и простая. Участвует в эксцизионной репарации (заполнение пробелов).

• ДНК-полимераза δ (дельта) - осуществляет синтез на отстающей цепи. Прикрепляется к цепи тримером из PCNA (фактор процессивности) и образует структуру, похожую на полимеразу III прокариот (не гомологичны!)

РНК затравки удаляются специальными белковыми факторами (FEN1/ MF1) и РНКзой

Репликация теломер

Полимераза может только добавлять новые нуклеотиды к свободной ОН-группе на 3’-конце -> она всегда будет недореплицировать отстающую нить и та раз за разом будет укорачиваться (основной фактор старения)

Теломераза состоит из теломеразной обратной транскриптазы (TERT),теломеразной РНК (hTR или TERC), и дискерина (по две молекулы каждого из этих веществ). Распознает шаблонные участки на концах хромосом и достраивает их к теломерам (3’-конец), удлинняя их (при помощи собственной РНК-матрицы).

Теломераза активна в половых и стволовых клетках, но в большинстве дифференцированных заблокирована.