Поливанова А.Г._Высокоэффективная жидкостная хроматография БАВ

Флуориметрический детектор. Принцип действия основан на измерении флуоресцентного излучения поглощённого света. Поглощение обычно проводят в УФ-области спектра, длины волн флуоресцентного излучения превышают длины волн поглощённого света. Флуориметрические детекторы обладают очень высокой чувствительностью и селективностью. Наиболее важная область их применения – детектирование ароматических полициклических углеводородов.

Кондуктометрический детектор используют для определения неорганических анионов и катионов в ионной хроматографии. Принцип его работы основан на измерении электропроводности подвижной фазы в процессе элюирования вещества.

Амперометрический детектор применяют для определения органических соединений, которые могут быть окислены на поверхности твёрдого электрода. Аналитическим сигналом является величина тока окисления. В детекторе имеется два электрода – рабочий и электрод сравнения (хлорсеребряный или стальной). Иногда устанавливают вспомогательный электрод, необходимый для подавления влияния омического падения напряжения в растворах низкой проводимости. Успех определения зависит от выбора материала и потенциала рабочего электрода. В амперометрическом детекторе используют электроды из углеродных материалов – наиболее часто стеклоуглеродный, и металлические: платиновый, золотой, медный, никелевый. Потенциал рабочего электрода устанавливают в интервале 0 ÷ +1,3 В. Можно проводить измерения либо при постоянном потенциале, либо в импульсном режиме, когда задаётся трёхступенчатая развертка потенциала, которая обеспечивает на разных стадиях окисление вещества, очистку электрода и его регенерацию. Использование амперометрического детектора особенно важно при определении фенолов, фенольных соединений, гидразинов, биогенных аминов и некоторых аминокислот.

Масс-спектрометрический детектор (масс-спектрометр) является исключительно информативным, он обладает высокой чувствительностью и селективностью. Работа детектора основана на измерении отношения массы заряженных частиц вещества (ионов) к их заряду (m/z) и измерении количества заряженных частиц, т.е. установлении одновременно и качественного и количественного состава веществ в выходящем из колонки элюате. В самом широком смысле масс-спектрометр – это прибор, использующий физические законы движения заряженных частиц в магнитных и электрических полях.

Первое, что надо сделать для того, чтобы получить масс-спектр, – перевести нейтральные молекулы и атомы, составляющие любое органическое или неорганическое вещество, в заряженные частицы – ионы. Этот процесс называется ионизацией и по-разному осуществляется для органических и неорганических веществ. Вторым необходимым условием является перевод ионов в газовую фазу в вакуумной части масс-спектрометра. Глубокий вакуум обеспечивает беспрепятственное движение ионов внутри масс-спектрометра, а

31

при его отсутствии ионы рассеются и рекомбинируют (превратятся обратно в незаряженные частицы).

Перед попаданием элюата в детектор должны быть решены две основные задачи: удаление растворителя и перевод содержащихся в элюате веществ в ионную форму (рис. 21). Для сохранения вакуума в ионном источнике массспектрометра необходимо удалять растворитель, поступающий из хроматографа со скоростью 0,5 – 5 мл/мин. Для этого часть жидкого потока пропускают через распылитель, в результате чего образуются капли, которые далее попадают в обогреваемую зону (испаритель), где большая часть растворителя испаряется. Для более глубокой осушки дополнительно используют высушивающий газ. Далее молекулы вещества попадают в ионный источник и ионизируются химически. Число образующихся при ионизации ионов пропорционально количеству поступающего вещества.

Рис. 21. Масс-спектрометрический детектор

Полученные при ионизации ионы с помощью электрического поля переносятся в масс-анализатор (на рис. 20 не показан). Там начинается второй этап масс-спектрометрического анализа – сортировка ионов по массам (точнее по отношению массы к заряду – m/z).

Существуют различные типы и виды масс-анализаторов:

-непрерывные масс-анализаторы (магнитный и электростатический секторный масс-анализатор, квадрупольный масс-анализатор);

-импульсные масс-анализаторы (времяпролётный масс-анализатор, ионная ловушка, квадрупольная линейная ловушка, масс-анализатор ионноциклотронного резонанса с Фурье-преобразованием).

Разница между непрерывными и импульсными масс-анализаторами заключается в том, что в первые ионы поступают непрерывным потоком, а во вторые – порциями, через определённые интервалы времени.

32

С помощью установленного в масс-анализаторе датчика, регистрируется параметр, по которому рассчитывается отношение m/z и регистрируется массспектр.

Таким образом, в ходе анализа через равные промежутки времени по мере элюирования компонентов смеси регистрируются масс-спектры, количественные характеристики которых накапливаются в памяти прибора. Для каждого сканирования производится сложение интенсивностей всех регистрируемых ионов. Так как эта суммарная величина (полный ионный ток) пропорциональна концентрации вещества в ионном источнике, то её используют для построения хроматограммы (эта величина откладывается по оси ординат, по оси абсцисс – время удерживания и номер сканирования). Задавая номер сканирования, можно вызвать из памяти масс-спектр в любой точке хроматограммы.

3.5.Хроматографы «Милихром А-02» и «Альфахром»

Влабораторном практикуме курса «Современные физико-химические методы анализа органических веществ» используются хроматограф «Милихром А-02» и его новая модификация – хроматограф «Альфахром» производства ЗАО «Институт хроматографии «ЭкоНова» (г. Новосибирск»).

Данные хроматографы состоят из двухшприцевого градиентного насоса объёмом 5000 мкл с возможностью подачи элюента в диапазоне объёмных скоростей от 5 до 1000 мкл/мин, автоматического дозатора на 46 проб, термостатируемой колонки размером Ø 2 × 75 мм с установкой температуры от 35 до 90 ºС (воспроизводимость установки ±0,1 ºС), спектрофотометрического детектора с возможностью многоволновой регистрации (до 8 длин волн одновременно) в диапазоне 190–360 нм и электронного блока. Максимально допустимое давление в гидравлической системе 7,1 МПа. Общий вид хроматографов показан на рис. 22.

Рис. 22. Хроматографы производства ЗАО «ЭкоНова»

Хроматографы «Милихром А-02» и «Альфахром» предназначены для работы в стационарных, мобильных или полевых лабораториях, выполняющих анализы для различных отраслей промышленности и науки. Конструкция и технические характеристики этих приборов обеспечивают:

33

-портативность: небольшая масса прибора – 17 кг, отсутствие необходимости в специально подготовленных помещениях для работы, возможность использования прибора для проведения анализа уже через 20 минут после распаковывания;

-низкий расход элюентов для проведения анализа – в 10–20 раз меньше по сравнению с аналогичными приборами, представленными на рынке жидкостных хроматографов.

Схема хроматографов показана на рис. 23. Хроматографы управляются компьютером с помощью программы «Альфахром» (ЗАО «ЭкоНова»); хроматограммы обрабатываются с помощью программы «МультиХром» (ЗАО «Амперсенд»).

Для виртуального обучения работе на хроматографах ЗАО «Институт хроматографии «ЭкоНова» разработана программа – тренажёр «Жидкостной хроматограф», которая виртуально имитирует процесс пробоподготовки и все функции прибора:

–управление хроматографом в ручном режиме;

–проведение анализа в ручном режиме;

–запись УФ спектра в диапазоне 190 – 360 нм;

–обработка хроматограмм.

Рис. 23. Схема хроматографов «Милихром А-02» и «Альфахром»

В хроматографах реализована инжекция пробы с остановкой потока. Весь анализ состоит из набора некоторых элементарных процедур, выполняемых по заданной программе.

-Набор элюентов в шприцевые насосы.

-Регенерация колонки (кондиционирование колонки) производится перед набором и инжекцией пробы. Смысл процедуры – заполнение колонки

34

элюентом с наименьшей элюирующей силой, что обеспечит минимальное размывание хроматографических зон в ходе элюции. Кроме того, эта процедура позволяет удалять пузырьки воздуха, которые могут возникнуть в гидравлической системе и в колонке в перерывах между анализами (когда в хроматографической системе отсутствует избыточное давление).

-Ввод пробы. Поток элюента останавливается, контур размыкается, для набора пробы игла поворачивается к нужной пробирке, опускается в неё, прокалывая пробку, отбирает заданное количество пробы (насосы работают на создание вакуума), поворачивается к системе, контур вновь замыкается, поток элюента восстанавливается (насосы включаются на подачу) и забранный раствор инжектируется в систему.

При необходимости отбору пробы может предшествовать набор буферного раствора (предсэмпл) из специального резервуара в иглу для уменьшения размытия пробы при введении в колонку.

-Элюция (элюирование) производится в соответствии с заданной программой насосами А и Б, либо одним из них в зависимости от заданной формы градиента подачи элюентов А и Б без переключения гидравлической системы и без перерыва после нанесения пробы. В процессе элюции работает детектор и данные об оптической плотности выходящего из колонки элюата на заданных длинах волн заносятся в компьютер. В процессе работы термостат может быть либо включён на определённую температуру, либо выключен. Измерение температуры не программируется.

-Промывка иглы осуществляется хроматографом для предотвращения взаимопереноса проб путём многократного ополаскивания инжекционной иглы последовательно в двух сосудах с промывочными растворами, установленных в автодозаторе.

-Промывка инжекционного порта осуществляется путём внешней промывки порта из поднятой над ним инжекционной иглы. В процессе хроматографии промывка производится либо в конце регенерации колонки, либо после окончания элюции с концентрацией элюента Б, которая была в этот момент.

Глава 4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Качественный и количественный анализ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

Качественный анализ или идентификация в жидкостной хроматографии проводится для того, чтобы получить ответ на один из двух вопросов:

-какому веществу соответствует каждый пик на хроматограмме анализируемой смеси;

-какому пику на хроматограмме соответствует искомое анализируемое вещество.

35

Для проведения идентификации в хроматографии исследователь должен иметь чистые вещества (стандарты или стандартные образцы сравнения),

наличие которых предполагается в анализируемой смеси.

Растворы стандартов определённой концентрации с известной погрешностью приготовления называются стандартными растворами.

Идентификация проводится следующим образом:

-подбирают оптимальные хроматографические условия для разделения веществ, содержащихся в анализируемой смеси;

-определяют времена удерживания веществ, содержащихся в анализируемой смеси;

-проводят хроматографический анализ стандартных растворов при тех же условиях, при которых проводили анализ исследуемой смеси, и определяют времена удерживания стандартов.

Если ни у одного хроматографического пика анализируемой смеси нет времени удерживания, близкого ко времени удерживания стандарта (в пределах 1–10 % погрешности), тогда искомое вещество в анализируемой смеси отсутствует.

Если в анализируемой смеси находится хроматографический пик со временем удерживания, близким к времени удерживания стандарта, то возможны следующие варианты:

-вещество стандарта и компонент анализируемой смеси – одно и то же соединение; в этом случае идентификация закончена;

-вещество стандарта и компонент анализируемой смеси – одно и то же соединение, но при этом на хроматограмме видно, что хроматографический пик компонента анализируемой смеси является не разделённым с хроматографическим пиком другого соединения. В этом случае необходимо изменить хроматографические условия, так чтобы разделить интересующие пики.

-вещество стандарта и компонент анализируемой смеси имеют близкие времена удерживания, но являются разными веществами; для выяснения такого факта необходим дополнительный к времени удерживания параметр стандарта

ианализируемого вещества.

Решение последней задачи значительно облегчает использование хроматографов “Милихром А-02” и “Альфахром”, спектрофотометрический детектор которых позволяет записывать хроматограммы на восьми длинах волн в течение одного анализа. Имея хроматограммы, записанные на нескольких длинах волн одновременно, можно рассчитать дополнительный параметр для идентификации – спектральное отношение. Спектральным отношением Q называется отношение площадей хроматографического пика на разных длинах

хроматограмм, записанных при длинах волн l1 и l2 соответственно.

36

Таким образом, совпадение двух параметров – времени удерживания и спектрального отношения пиков компонента смеси и стандарта позволяет однозначно утверждать, что компонент смеси и стандарт – это одно и то же вещество.

Для количественного анализа в ВЭЖХ в основном используют метод внешнего стандарта. Количественный анализ проводят при условии, что подобраны оптимальные условия хроматографического анализа и проведена идентификация интересующего компонента анализируемой смеси.

Последовательность проведения количественного анализа следующая:

-готовят стандартные растворы интересующего соединения, содержащегося в анализируемой смеси (не менее трёх);

-производят градуировку хроматографа по стандартным растворам определяемого соединения, т.е. записывают хроматограммы стандартных растворов и строят градуировочный график – зависимость концентрации определяемого соединения от площади его хроматографического пика; градуировочный график строят таким образом, чтобы ожидаемый диапазон концентраций определяемого соединения в исследуемой смеси находился в середине градуировочной кривой;

-определив площадь хроматографического пика анализируемого соединения из хроматограммы анализируемой смеси, по градуировочному графику устанавливают концентрацию определяемого соединения.

4.2.Пробоподготовка в высокоэффективной жидкостной хроматографии

Пробоподготовка – один из важнейших этапов проведения хроматографического анализа. От того, насколько качественно и квалифицированно проведен процесс пробоподготовки, во многом зависит результат хроматографического анализа в целом, а также срок эксплуатации хроматографической колонки. Подготовка проб для анализа преследует цели:

-перевод образца в растворитель, совместимый с используемой хроматографической системой;

-удаление компонентов и механических примесей, отрицательно влияющих на работу хроматографической колонки;

-предварительное отделение таких компонентов, которые не представляют интереса либо затрудняют анализ;

-обогащение пробы определяемыми компонентами;

-перевод компонентов пробы в форму, способствующую селективному разделению, а также чувствительному и селективному детектированию.

Для приготовления пробы следует применять растворители, обладающие по возможности наименьшей элюирующей силой. В этом случае происходит минимизация размывания хроматографической зоны на входе в колонку и улучшается эффективность разделения, особенно для слабоудерживаемых компонентов разделяемой смеси. В теории наилучшим растворителем можно

37

считать основу элюента (например, вода для ОФ ЖХ), вполне удовлетворительным – сам элюент (например, смесь воды и ацетонитрила для ОФ ЖХ).

При проведении анализов ВЭЖХ приходится работать с очень малыми количествами веществ и нередко даже с растворами, концентрация вещества в которых составляет менее 10 мг/л. В связи с этим, для минимизации потери вещества при работе с микрообъёмами растворов необходимо соблюдать некоторые общие рекомендации:

-для гидрофобных растворов аналитов следует использовать посуду из стекла;

-для гидрофильных растворов аналитов желательно использовать посуду из полимерных материалов (фторопласты, полипропилен);

-коэффициент заполнения посуды раствором должен быть максимально большим;

-с окисляемыми аналитами следует работать в инертной атмосфере или в присутствии антиокислителей;

-с фоточувствительными аналитами следует работать, используя тёмную или непрозрачную посуду;

-с термолабильными аналитами следует работать при пониженной температуре;

-хранить растворы образцов следует при низких температурах в герметичной посуде; нейтральные водные растворы лучше хранить в замороженном виде.

Подготовка проб для анализа веществ, содержащихся в объектах окружающей среды или биообъектах, включает следующие этапы:

-извлечение анализируемых веществ из объекта (чаще всего методом экстракции);

-очистка и обогащение образца (концентрирование экстракта);

-приготовление раствора для ввода в хроматограф.

Как правило, для анализа готовят две параллельные пробы, а анализ проводят несколько раз (как минимум два) для каждой пробы.

Обогащение пробы (концентрирование раствора аналита). Для обогащения анализируемого вещества в пробе используют экстракцию, адсорбцию и осаждение, причём эти методы могут быть использованы также для извлечения анализируемых веществ из объекта и для удаления примесей из анализируемого раствора. Ниже приведены примеры использования этих методов для решения некоторых конкретных аналитических задач.

Экстракция:

-экстракция ароматических полициклических углеводородов из воды для определения бензо(а)пирена;

-удаление липидов экстракцией гексаном из сыворотки крови при определении содержания лекарственных препаратов;

-удаление ароматических полициклических углеводородов из воды экстракцией гексаном перед определением бензойной кислоты.

38

Адсорбция:

-адсорбция катионов из воды на полистирольном катионообменнике с последующим его озолением для определения тяжёлых металлов;

-удаление воды из моторного топлива адсорбцией на активированном оксиде алюминия перед определением алканов.

Осаждение:

-концентрирование ионов железа (III) путём их осаждения в виде сульфида железа;

-удаление хлорид-иона (осаждение нитратом серебра), мешающего определению нитрит-иона методом ионной ВЭЖХ;

-удаление белков из сыворотки крови после добавления в неё равного объёма ацетонитрила перед определением мочевой кислоты.

Кроме того, для обогащения анализируемого вещества используют различные способы разложения примесей. Например, озоление органических веществ перед определением тяжёлых металлов в зерне или щелочной гидролиз триглицеридов перед определением в жире полихлорбифенилов.

Для концентрирования экстракта в случае маленьких объёмов (до 500 мкл) могут быть использованы следующие приёмы:

-упаривание микрообъёма раствора с помощью потока инертного газа: пробирка с раствором помещается в стакан с горячей водой (рис. 24а) или термостатируемую ёмкость (рис. 24б) и в неё продувается инертный газ, который уносит с поверхности раствора пары растворителя, в результате чего раствор упаривается.

-упаривание в вакуумной центрифуге (рис. 24с).

Рис. 24. Способы упаривания микрообъемов

В некоторых случаях в процессе пробоподготовки на разных этапах используют химическую дериватизацию. Дериватизация — это получение производных анализируемого вещества, обладающих иными (лучшими с точки зрения используемого аналитического метода или способа пробоподготовки) аналитическими или физико-химическими свойствами (например, иным УФспектром, лучшей термической и химической стабильностью, иной растворимостью и пр.). Основными целями дериватизации являются:

39

увеличение селективности разделения и чувствительности детектирования целевых компонентов. К примеру, многие полярные (карбоновые кислоты, альдегиды, амины и пр.) и реакционноспособные (галогенводороды, азиды и пр.) соединения с трудом поддаются прямому хроматографическому анализу. В этом случае дериватизация не только облегчает анализ, но часто позволяет реализовать саму возможность хроматографического определения. Кроме того дериватизацию с применением хиральных реагентов эффективно используют при детектировании диастереомеров, которые имеют при прямом определении очень близкие времена удерживания.

Ниже показаны примеры химической дериватизации при определении фенольных соединений в воде.

Пример 1. Определение фенолов в воде:

В первом примере пробу обрабатывают уксусным ангидридом. Образующиеся при этом сложные эфиры хорошо экстрагируются органическими растворителями (например, гексаном). Полученные экстракты далее упаривают, а остаток растворяют в небольшом объёме оптимального для проведения хроматографического анализа растворителя.

Пример 2 демонстрирует вариант использования дериватизации для увеличения селективности хроматографического анализа. В исходном состоянии анализируемой смеси при проведении обращёно-фазового анализа ВЭЖХ хроматографические пики всех кислот, содержащихся в пробе, имеют очень близкие времена удерживания и идентифицировать их не представляется возможным. При обработке анализируемой смеси фенилтиоизоцианатом происходит модификация аминокислот; образующиеся при этом фенилтиокарбамильные производные аминокислот будут иметь на хроматограмме пики с большими временами удерживания, чем пики карбоновых кислот и провести идентификацию веществ, содержащихся в пробе, будет намного легче.

Важным моментом подготовки пробы непосредственно перед вводом в

хроматограф является удаление механических микроскопических примесей, которые всегда присутствуют в приготовленном растворе (содержались в

40