Поливанова А.Г._Высокоэффективная жидкостная хроматография БАВ

- параметр S, который отражает чувствительность величин удерживания к изменению состава подвижной фазы. Эта величина предложена для ОФ ЖХ.

Свойства растворителей, используемых в ВЭЖХ, приведены в табл. 2.

Всоответствии с табл. 2 можно составить элюотропный ряд растворителей для ОФ ЖХ, например, в соответствии с адсорбционной силой на силикагеле: вода – метанол – 2-пропанол – ацетонитрил – тетрагидрофуран – хлороформ.

Вобращённо-фазовом варианте ЖХ применяются в основном воднометанольные, водно-ацетонитрильные или водно-ацетонитрильно-метанольные смеси растворителей. 2-Пропанол, тетрагидрофуран и хлороформ используются значительно реже.

Любой органический растворитель, используемый в смеси с водой в элюенте для ОФ ЖХ, называется модификатором.

Значение воды в ОФ ЖХ не ограничивается ролью самого слабого элюента, особенно при анализе ионогенных соединений. Например, бензойная кислота элюируется водой, но не элюируется значительно более сильным элюентом – ацетонитрилом. В данном случае вода выполняет две функции (которые не может выполнить такой апротонный растворитель, как ацетонитрил):

-адсорбционная модификация остаточных силанольных групп на поверхности модифицированных гидрофобных силикагелей;

-ионизация и сольватация бензойной кислоты, приводящая к уменьшению

21

удерживаемого объёма бензойной кислоты.

Селективность подвижных фаз по отношению к компонентам разделяемой смеси связана с их способностью к специфическим взаимодействиям с адсорбатами, которые определяются их структурными особенностями. Благодаря разному характеру взаимодействий значение элюирующей способности по отношению к адсорбатам различного строения будет отличаться, что и позволит их разделить. Селективность, как и элюирующая способность, определяется в первую очередь природой более сильного компонента смеси.

Существует несколько основных правил для регулирования селективности

вОФ ЖХ:

-элюирующая сила подвижной фазы в ОФ ЖХ регулируется содержанием модификатора (ацетонитрила, метанола, 2-пропанола и др.) в элюенте типа «вода-модификатор»; чем больше модификатора в элюенте, тем больше элюирующая сила элюента, тем меньше объём удерживания разделяемых веществ;

-для увеличения селективности элюента и улучшения разделения соединений, имеющих несколько ОН-групп, полезно использовать смешанный модификатор в соотношении 1 : 1 (смеси метанол-этанол, метанолацетонитрил, этанол-изопропанол и др.);

-симметричная форма хроматографических пиков (отсутствие эффекта уширения хроматографического пика) при разделении средне- и сильнополярных соединений достигается слабым подкислением элюента; в отсутствии подкисляющего агента ионогенный адсорбат существует в растворе

ввиде двух равновесных форм – молекулярной и ионной, каждая из которых имеет своё время удерживания. В результате хроматографический пик адсорбата уширяется; при подкислении элюента равновесие системы «молекула адсорбата – молекулярный ион адсорбата» смещается в сторону молекулярной формы адсорбата и уширения хроматографического пика не происходит;

-увеличение времени удерживания ионогенного адсорбата достигается путём добавления неорганических солей в элюент. Смысл процедуры заключается в эффекте «высаливания» органических соединений на границу раздела «адсорбент-элюент» и увеличении межфазного поверхностного натяжения «элюент-адсорбат», что в свою очередь приводит к увеличению энергии взаимодействия «адсорбат-адсорбент».

Глава 3. Жидкостной хроматограф

Современный жидкостный хроматограф – сложный автоматизированный прибор (рис. 11). Все узлы такого прибора по своей сути являются вспомогательными элементами по отношению к хроматографической колонке, где протекает процесс разделения. Помимо колонки, необходимыми компонентами любого хроматографа являются: насос, дозатор и детектор. С помощью насоса в колонку под давлением подаётся элюент. Дозатор

22

необходим для ввода в колонку пробы заданного объёма. Детектор регистрирует количество анализируемого вещества, растворённого в элюате.

Рис. 11. Современный жидкостной хроматограф

Для решения конкретных практических задач разработаны различные виды жидкостных хроматографов:

-аналитические хроматографы – качественное и количественное определение состава мало- и многокомпонентных смесей различных веществ;

-препаративные хроматографы – выделение индивидуальных соединений из смеси в чистом виде;

-промышленные хроматографы – определение следовых количеств неорганических и органических веществ в промышленных стоках, выделение значительных количеств индивидуальных соединений из смесей;

-полевые хроматографы – оперативный контроль состояния и состава природных и техногенных сред и объектов (водоёмов, почв, приземного слоя атмосферы, мест захоронения отходов и т.д.).

3.1.Хроматографическая колонка

Хроматографическая колонка – центральная, принципиально главная часть жидкостного хроматографа и хроматографической системы. Колонка для ВЭЖХ, заполненная определённым адсорбентом, является по сути, промышленно выпускаемым изделием. Обычно колонка имеет геометрию удлинённого цилиндра с жёсткими стенками, изготовленного из металлических (стальных), стеклянных или полимерных трубок (рис. 12).

23

3.2. Основные типы насосов, используемых в высокоэффективной жидкостной хроматографии

Наиболее распространёнными в ВЭЖХ являются насосы плунжерного типа. Плунжерный насос работает по принципу шприца. Его основными элементами являются рабочая камера с поршнем и двумя клапанами – на выходе и на входе. На рис. 14а представлена схема одноплунжерного насоса. Первую половину цикла такой насос работает на забор жидкости: поршень движется из рабочей камеры, клапан на вход открыт, клапан на выход закрыт. Вторую половину цикла насос работает на подачу жидкости: поршень движется внутрь рабочей камеры, клапан на вход закрыт, клапан на выход открыт (рис. 14а). Значительным недостатком одноплунжерных насосов является невозможность обеспечить непрерывный поток жидкости и как следствие довольно большие пульсации потока, которые являются основной причиной повышенного шума и снижения чувствительности детектора.

Рис. 14. Схемы насосов плунжерного типа.

а – одноплунжерный насос, б – двухплунжерный насос

Непрерывность потока подаваемого элюента достигается при использовании двухплунжерного насоса, который имеет два поршня, двигающихся в противофазе (рис. 14б). В момент, когда одна камера насоса работает на забор жидкости, другая работает на подачу и, наоборот.

В микроколоночных жидкостных хроматографах, где для проведения одного хроматографического анализа требуется небольшой объем элюентов (около 5000 мкл), возможно применение прецизионных насосов шприцевого типа. Принцип работы таких насосов заключается в следующем: вращение прецизионного синхронного двигателя преобразуется в перемещение поршня в цилиндре; при движении поршня подвижная фаза (элюент) либо поступает в цилиндр, либо выдавливается из него. Преимущество такого насоса – практически полное отсутствие пульсаций потока подвижной фазы, недостаток

– невозможность проводить градиентное элюирование с помощью одного насоса.

25

В случае градиентного элюирования (рис. 15) используют два или несколько шприцевых насосов (в зависимости от количества компонентов в элюенте).

Рис. 15. Система шприцевых насосов для градиентного элюирования

Компоненты элюента подают сначала в смеситель, а затем уже в колонку.

3.3. Дозаторы для высокоэффективной жидкостной хроматографии

Системы ввода пробы для ЖХ можно разделить на ручные инжекторы и автоматические инжекторы (автосамплеры).

Среди ручных инжекторов наиболее распространён петлевой крандозатор (рис. 16), в состав которого входят сменные петли из химически стойкого материала (легированной стали) с определёнными объёмами. Для аналитической жидкостной хроматографии объём петли варьирует в пределах 5 – 100 мкл, в препаративной ЖХ её объём доходит до нескольких мл. Пробу вводят в петлю заданной вместимости при давлении, близком к атмосферному, с помощью микрошприца или шприца. Затем поворотом крана петля сообщается с линией подачи растворителя от насоса и входом в колонку, после чего проба вымывается из петли и попадает в колонку.

Рис. 16. Петлевой кран-дозатор инжектора

26

Ручные инжекторы в жидкостных хроматографах 5-го поколения вытесняются автоматическими инжекторами – автосамплерами, которые в соответствии с заданной программой могут последовательно вводить от 20 до 100 и более образцов (рис. 17). Они автоматически обеспечивают выполнение всех циклов ввода пробы: промывку петли, заполнение, ввод пробы в колонку. При этом могут быть заданы последовательность анализа образцов и число вводов одной и той же пробы. Практически все автоматизированные системы ввода пробы управляются микропроцессорной техникой, связанной через интерфейс с компьютером, оснащённым соответствующим пакетом программ.

Среди всего многообразия конструкций автоматических дозаторов можно выделить автосамплеры с заполнением петли методом вакуумирования и автосамплеры с заполнением петли методом нагнетания.

Рис. 17. Инжекция образца в колонку автосамплером

Принцип действия устройств первого типа основан на отрицательном давлении, создаваемом, как правило, при помощи шприца, в результате чего проба заполняет петлевой дозатор инжектора. Эти устройства давно завоевали популярность благодаря своей простоте и надёжности. Недостатком же такой конструкции является повышенный расход пробы (для того, чтобы заполнить петлю, необходимо сначала заполнить пробой иглу и соединительный капилляр).

Большинство современных автосамплеров используют технику положительного заполнения петли пробой – методом нагнетания. Данная техника схожа с техникой ручного ввода пробы. Шприц подходит к пузырьку с пробой, забирает заданный объём и вводит его в кран-дозатор, заполняя петлю. Заполнение шприца и ввод пробы контролируются шаговым двигателем, благодаря чему обеспечивается очень точное дозирование пробы. При этом снижается избыточный расход пробы по сравнению с устройствами для заполнения петли вакуумированием.

27

3.4. Детекторы для высокоэффективной жидкостной хроматографии

Основные виды детекторов и их характеристики приведены в табл. 3.

Спектрофотометрический детектор является наиболее распространённым детектором в адсорбционной ВЭЖХ. В процессе элюирования веществ в специально сконструированной микрокювете измеряется оптическая плотность элюата при выбранной длине волны (одной или нескольких). Такие детекторы измеряют поглощение света в ультрафиолетовой (УФ-детектор) или видимой (Вид-детектор) области спектра, причём первый вариант используется чаще. Это связано с тем, что большинство химических соединений имеют достаточно интенсивные полосы поглощения в диапазоне длин волн 200 – 360 нм.

Закон Бугера – Ламберта – Бера определяет ослабление параллельного монохроматического пучка света при распространении его в поглощающей среде (рис. 18) и выражается следующей формулой:

I = I0 Ч10-ελЧCЧl , где I – интенсивность выходящего пучка света, I0 – интенсивность входящего пучка света, ελ – коэффициент, характеризующий взаимодействие молекулы поглощающего вещества со светом длиной волны λ, l – толщина слоя вещества, через которое проходит свет (толщина кюветы), С – концентрация растворённого вещества в кювете.

Рис. 18. Ослабление пучка света при распространении его в поглощающей среде

28

определяется шириной спектральной щели, которая в стандартных фотометрических детекторах составляет 5 нм, т.е. если детектору задана длина волны 254 нм, то реально от дейтериевой лампы пропускается свет в интервале от 251,5 до 256,5 нм.

Далее монохроматический свет попадает на проточную кювету 5, через которую прокачивается элюат. Интенсивность прошедшего через элюат света регистрируется фотоумножителем или фотодиодом 6.

В настоящее время более широкое применение находят двухлучевые спектрофотометрические детекторы (рис. 20), которые позволяют проводить измерения одновременно на двух длинах волн.

Рис. 20. Двухлучевой спектрофотометрический детектор хроматографа «Милихром А-02»

Фотометрические детекторы имеют достаточно высокую чувствительность. Чувствительность УФ-детектора может достигать 0,001 ед. оптической плотности на шкалу при 1 % шума. При такой высокой чувствительности может быть зафиксировано до нескольких нанограмм даже слабо поглощающих УФ-свет веществ. Широкая область линейности детектора позволяет анализировать как примеси, так и основные компоненты смеси на одной хроматограмме. Возможности спектрофотометрического детектора существенно расширились после появления его современного аналога – детектора на диодной матрице (ДДМ), работающего как в УФ-, так и видимой областях. В таком детекторе «матрица» фотодиодов (их более 200) постоянно регистрирует поглощение электромагнитного излучения в режиме сканирования. Это позволяет записывать при высокой чувствительности неискажённые спектры быстро проходящих через ячейку детектора компонентов. По сравнению с детектированием на одной длине волны сравнение нескольких спектров, полученных в процессе элюирования пика, позволяет идентифицировать разделяемые компоненты с гораздо большей степенью достоверности.

30