Характеристика препаратов нуклеиновых кислот

 Реактивы: раствор ДНК – 0,003 %.

Оборудование: спектрофотометр, термостат.

Ход работы

Чистоту препаратов  нуклеиновых кислот определяют по спектру поглощения препарата в ультрафиолетовой области и по величине отношений Е₂₆₀ : Е₂₃₀  и  Е₂₄₀ : Е₂₈₀.

В спектрофотометрическую кювету наливают 3 мл раствора ДНК (0,003%) и на спектрофотометре измеряют оптическую плотность (Д) при длине волн: 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 нм.

  На основе полученных данных строят график зависимости Д (ДНК) от длины волны, т.е спектр поглощения ДНК. Находят максимум поглощения в ультрафиолетовом свете препарата ДНК. Затем определяют  отношения Е₂₆₀ : Е₂₃₀  и  Е₂₄₀ : Е₂₈₀. Для препаратов нуклеиновых кислот достаточно хорошо очищенных от примесей белков и полисахаридов, эти показатели должны быть в пределах 2,1 – 2,4. Делают вывод о чистоте исследованного препарата ДНК.

Лабораторная работа №5

Количественное определение днк

 Метод основан на свойстве дезоксирибозы, входящей в состав ДНК, образовывать синее окрашивание прямо пропорциональное концентрации ДНК.

Реактивы: дифениламиновый реактив (1 г дифениламина в 100 мл ледяной уксусной кислоты, + 2,75 мл H₂SO₄ конц.), дистиллированная вода, водный раствор ДНК.

Оборудование: термостат, спектрофотометр, автоматические пипетки, пробирки, штатив.

Ход работы

Вначале  необходимо построить калибровочный график. Для этого в 3 пробирки наливают по 1мл раствора ДНК с различной концентрацией (50, 100, 200 мкг/мл) и по 2 мл дифениламинового реактива. Помещают пробирки на 10 – 15 минут в кипящую водяную баню для развития окраски, затем определяют оптическую плотность каждого из растворов при длине волны 595 нм. Калибровочный график строят, откладывая по оси абсцисс концентрацию использованных растворов ДНК, по оси ординат – соответствующие им значения оптической плотности.

Затем берут две пробирки: в контрольную пробирку наливают 1 мл воды, в опытную пробирку – 1 мл водного раствора ДНК (неизвестной концентрации). В каждую пробирку добавляют по 2 мл дифениламинового реактива. Обе пробирки помещают на 10 – 15 минут в кипящую водяную баню. Затем пробы охлаждают и измеряют насыщенность окраски против контроля  при λ = 595 нм. Зная оптическую плотность пробы, по калибровочному графику находят количество ДНК в ней.

Состав проб

 

Про– бирки	ДНК (мл)				Дифенил– аминовый реактив (мл)	H2O (мл)
	50 (мкг/мл)	100 (мкг/мл)	200 (мкг/мл)	Х (мкг/мл)
1	1	–	–	–	2	–
2	–	1	–	–	2	–
3	–	–	1	–	2	–
Х	–	–	–	1	2	–
К	–	–	–	–	2	1
10 – 15 мин кипящ. водян. баня
охладить, измерить оптич. плотность при λ=595 нм

Тема: ФЕРМЕНТЫ

 Ферменты (от латинского fermentatio —  брожение) можно определить как белки, которые благодаря своей способности к специфическому активированию молекул веществ, обладают каталитическими  свойствами. Как всякое определение, это определение имеет ряд спорных моментов, например,  под него не подходит такой каталитический белок, как цитохром С, так как является лишь переносчиком электронов.

Наука, изучающая ферменты, получила название  энзимология (термин «энзим» ввел Кюне в1878 г.).  Энзимология представляет важнейший раздел биохимии, т.к. сама жизнь представляет сложную совокупность химических реакций, катализируемых специфическими ферментами. Любые нарушения в функционировании  ферментов в живой клетке могут повлечь серьезные изменения в организме.

Активация молекул субстрата в ходе ферментативной реакции происходит за счет образования специфического активированного комплекса фермент  — субстрат, что сопровождается изменением энергии молекулы субстрата и способствует ее переходу в продукт.

Измерение скорости ферментативной реакции является важнейшим элементом методики исследования ферментов.  Количество субстрата, прореагировавшего за определенный промежуток времени, может рассматриваться как показатель скорости реакции (при определенных условиях). При этом измеряют либо концентрацию расходующегося субстрата, либо   образующегося продукта.

При работе с ферментами следует соблюдать ряд требований. Ферменты относительно неустойчивые соединения, нельзя допускать  их инактивации.  Общими требованиями является постоянство рН среды, температуры, соотношения концентраций фермента и субстрата.

Среди параметров, характеризующих свойства фермента, и определяемых  экспериментальным путем следует выделить: структуру – аминокислотный состав, число пептидных цепей,  наличие коферментов и т.д.;  свойства –природа катализируемой реакции, субстратная специфичность, действие ингибиторов и активаторов; кинетические характеристики – удельная активность, диссоциация фермент-субстратного комплекса; термодинамические свойства – константы равновесия ферментативной реакции, величина свободной энергии, энтропии и энтальпии реакции, энергия активации комплекса фермент-субстрат, константа Михаэлиса; биологические свойства – значение фермента в обмене веществ, распространенность,  внутриклеточная локализация, генетические мутации.

Наиболее общепринятым считают определение удельной активности фермента как «числа микромолей субстрата, превращаемых за 1 мин 1 мг фермента».

Особое значение имеет константа, характеризующая сродство фермента к субстрату. Зависимость скорости ферментативной реакции υ от концентрации субстрата S в подавляющем большинстве случаев описывается уравнением

υ =V S / S + К_М,

_,где υ – скорость реакции при концентрации субстрата S, V —  максимальная скорость реакции, достигаемая при концентрации субстрата, достаточно высокой для насыщения фермента, К_М – константа Михаэлиса.

В состав  многих ферментов входят коферменты низкомолекулярные органические соединения, которые обусловливают активность ферментов и образуют с апоферментами диссоциирующие комплексы. Коферменты служат переносчиками химических групп, атомов водорода, электронов, в большинстве случаев представляют производные витаминов, например, пиридоксаль-5-фосфат, тиаминдифосфат, кофермент А.

ЛАБОРАТОРНАЯ  работа №1