Применение иммуносерологических реакций в ихтиологии
На протяжении многих лет иммунологические исследования концентрировались, главным образом, в области патологии инфекций. Подмеченная еще И. И. Мечниковым и его многочисленными учениками возможность использования иммунологических реакций для решения вопросов, не связанных с проблемой инфекции, долгое время не была надлежащим образом оценена.
С открытием в 20-х годах этого столетия групповых и типовых антигенов тканей иммунологические исследования стали широко применять в судебной медицине, санитарной экспертизе, переливании крови, а также для определения видовых и внутривидовых различий животных.
Необычайная чувствительность и точность этих методов исследования позволила использовать их в различных областях биологии: в систематике, эмбриологии, энтомологии, генетике, ихтиологии и т. д.
Благодаря усовершенствованию иммунологических методов исследования удалось обнаружить внутривидовые различия в самых различных группах животного мира: у грызунов (Хикс и Литли, 1931; Аврех и Калабухов, 1937; Ларина и Кулькова, 1959), птиц (Соколовская, 1936, 1938; Ирвин и Коль, 1936 а, б), дрозофил (Гершензон, Геронимус и Аврех, 1936), морских свинок (Линдштейнер, 1931) и т. д.
Иммуносерологические методы оценки внутривидовой изменчивости рыб привлекают за последние годы все возрастающее внимание и в зарубежных странах и в СССР; несомненно их значение будет увеличиваться по мере накопления опыта и дальнейшего совершенствования иммуносерологических методов. Эти методы позволяют установить различия не только между видами или подвидами, но и между внутривидовыми группировками. Это положение подтверждается исследованиями Нересгеймера (Neresheimer, 1908, 1909), который при помощи реакции преципитации доказал, что ручьевая форель весьма близка к лососю — тайменю и к озерной форме и, что не только морфологически, но и серологически эти формы представляют собой одну общую группу, тогда как американская радужная форель далека от европейской; Кодама (Kodama, 1913) при помощи реакции преципитации показал, что подклассы Chondrosteidae и Teleostei резко разграничены, а в последнем в свою очередь весьма резко разграничены семейства Clupeidae, Salmonidae и Cyprinidae; Джемерой (Gemeroy, 1943) провел на 31 виде рыб около 500 реакций; 0'Рурке (O'Rourke, 1959, 1960) проводил аналогичную работу при изучении родства близких видов и родов Gadus и Sebastes.
Основоположником изучения внутривидовой дифференциации у рыб является Д. Н. Талиев, обнаруживший серологические различия между расами байкальского омуля и хариуса. В ряде исследований (Талиев и Базикалова, 1934; Талиев, 1940) изложены результаты, полученные путем применения серологических методов для изучения истории байкальской фауны.
При изучении происхождения фауны озера Байкал Д. Н. Талиев и А. Я. Базикалова установили, что байкальская фауна смешанного происхождения, некоторые ее формы родственны северным морским рыбам, а часть их близко стоит к дериватам Каспийского бассейна.
В 1941 г. в работе «Серологический анализ рас байкальского омуля» Д. Н. Талиев использовал цельные и абсорбированные антисыворотки для реакции преципитации. В результате этих работ ему удалось установить три формы байкальского омуля. При определении родства сига с хариусом и ленком оказалось, что оба эти вида далеки от сига, но ленок более отдален, чем хариус.
Большой интерес представляет серологический анализ рас некоторых диких и одомашненных форм сазана (Талиев, 1946в). Оказалось, что степень отдаленности как чешуйчатого, так и разбросанного карпа по отношению к параванскому сазану одинакова, а родство амурских и параванских сазанов более отдалено, чем карпов и параванского сазана.
На основе своих многочисленных исследований Д. Н. Талиев пришел к выводу, что результаты серологических исследований не противоречат морфологическим данным, и иммуносерологические методы играют важную роль для определения начальных этапов внутривидовой изменчивости у рыб.
М. Г. Закс и М. М. Соколова (1961) использовали реакции кольцепреципитации и преципитации на агаровых пластинках по методу Оухтерлони для выяснения внутривидовых различий лососевых рыб Дальнего Востока. Вся работа была проведена на четырех стадах нерки, входящих на нерест в различные реки в разное время года. Результаты перекрестных реакций кольцепреципитации и преципитации на агаровых пластинках по методу Оухтерлони совпадали почти во всех случаях.
В результате проведенных исследований было установлено, что между локальными стадами нерки имеются определенные различия и родство, являющиеся доказательством наличия антигенно-серологической специфичности белков протоплазмы этих отдельных стад.
В 1961 г. Ю. П. Алтухов применил иммунологическую методику параллельно с цитофизиологической с целью определения влияния пола и возраста некоторых рыб на теплоустойчивость и степень серологической близости их мышечных белков.
По мнению автора, параллельное применение обеих методик, взаимно дополняя и контролируя друг друга, может сыграть большую роль при решении спорных вопросов систематики.
Для проведения серологического анализа Ю. П. Алтухов применил реакцию кольцепреципитации с сильно разведенными антисыворотками без истощения. Результаты серологического анализа оказались в полном соответствии с данными по теплоустойчивости. Пол и возраст различных рыб не оказывали существенного влияния на специфику их клеточных белков.
И. А. Балахнин (1961) использовал для определения внутривидовых различий крови форелей другую иммунологическую реакцию — гемоагглютинацию, основанную на выявлении внутривидовых антигенных различий в эритроцитах рыб. Ему удалось обнаружить внутривидовые различия не только у форелей, но и у карпа.
В 1963 г. Ю. П. Алтухов и В. С. Апекин при помощи реакции кольцепреципитации установили четкое серологическое различие между «крупной» и «мелкой» ставридами Черного моря, а также между этими формами и двумя видами Trachurus.
Различие между «крупной» и «мелкой» ставридой носит тот же характер, что и отличия этих форм от самостоятельных видов Trachurus. На основании этих данных можно считать, что формы ставрид, обитающие в Черном море, являются самостоятельными видами.
В последнее время появилось много американских, канадских, японских и французских работ, авторы которых пытаются устанавливать различия и родство между отдельными популяциями внутри одного вида по особенностям изо- или гетероагглютинации.
Известна работа Кушинга и Спрейг (Cushiing and Sprague, 1953), изучавших агглютинацию эритроцитов различных рыб посредством человеческой и других сывороток для установления родственных связей рыб по группоспецифическим свойствам их эритроцитов.
Риджвей, Кушинг и Дювалл (Ridgway, Gushing, Duvall, 1958) провели ряд работ с целью выявления различий популяции нерки серологическими методами.
Различия между отдельными популяциями нерки, добытой в разных районах, они устанавливали на основе неодинаковой степени агглютинации эритроцитов нерки свиной сывороткой.
В 1960—1961 гг. французский исследователь Ж. Ли (по Балахнину, 1962) при помощи реакций гемоагглютинации обнаружил различия между сардинами из трех районов одного и того же залива Средиземного моря.
Результаты серологического анализа согласовывались с данными по морфологии и биологии, и позволили утверждать, что сардины этого залива не однородны между собой.
Ряд исследователей выявляют внутривидовые группировки у рыб при помощи различных модификаций реакции агглютинации (Талиев, 1935; Кушинг и Дювалл, 1957; Сузуки, Мимото и Морио, 1959; Синдерман и Майрс, 1959; Риджвей и Клонтц, 1960).
Риджвей, Клонтц и Мотсумото (Ridgway, Clontz, Matsumoto, 1959) применили реакцию преципитации на агаровых пластинках по методу Оухтерлони для доказательства серологических различий между неркой Американского и неркой Азиатского побережий Тихого океана. При помощи этой реакции они обнаружили в сыворотке нерки Американского побережья 14 антигенов, а в сыворотке нерки Азиатского побережья—только 12. Таким образом, можно установить различие между нерками, выловленными в различных районах Тихого океана. Было обнаружено также присутствие особого антигена, характерного для половозрелых и созревающих самок нерки.
В течение последних лет методика постановки реакции преципитации в агаре получила широкое распространение при исследовании антигенного состава сыворотки животных и экстракта животных тканей.
Французский исследователь Кейванфар (Keyvanfar, 1962) применил реакцию преципитации в агаре по методу Оухтерлони при установлении различий между популяциями тунцов Атлантики и Средиземного моря. Он установил присутствие Одного антигена в сыворотке длинноперого тунца Атлантики, не содержащегося в сыворотке этого вида, обитающего в Средиземном море.
Автор приводит большое количество работ, которые делятся на две части: 1) исследование групп крови, 2) электрофоретическое и иммунологическое исследования сывороточных белков.
При изучении крови длинноперых тунцов Атлантики были установлены четыре группы крови. Эритроциты длинноперых тунцов из Средиземного моря также могут быть разделены на те же четыре группы. При этом была обнаружена четкая разница в распределении групп крови у длинноперых тунцов Атлантики и Средиземного моря.
Электрофоретический и иммуно-электрофоретический анализы дали возможность Кейванфару установить различия только между видами тунцов. Внутривидовые различия при помощи этого метода установлены не были.
Изучение белкового состава крови рыб, его изменчивости у разных экологических групп и при разном физиологическом .состоянии организма начато сравнительно недавно и развивается медленно. Нет данных о сезонных изменениях белкового состава крови проходных рыб и факторах, их определяющих. Материалы, относящиеся к рыбам пресных вод, показывают, что картина крови в течение зимы претерпевает весьма существенные изменения.
В последние годы некоторые зарубежные исследователи для целей систематики применяют метод электрофоретического разделения белков крови или других тканей на фильтровальной бумаге.
Так, Дриглон (Drihion, 1954) проводил электрофоретический анализ сывороточных белков крови самцов и самок угря и карпа.
При электрофоретическом исследовании белков плазмы крови у тресковых рыб К. М. Хайлов (1962) наблюдал отчетливые межродовые различия по количеству альбуминов и альфа-бетаглобулинов.
На основе полученных данных авторы пришли к выводу, что электрофоретические исследования имеют большое значение для выяснения степени родства или различия между отдельными таксономическими группами рыб.
Для изучения внутривидовой дифференциации осетровых рыб Каспийского моря Г. А. Амирханов использовал комплекс иммуносерологических реакций и метод электрофореза на бумаге.
В 1961 и 1962 г. были исследованы 116 экз. рыб (53 осетра „и 63 севрюги) 'из Волги, Терека, Сулака, Самура и Куры в период весенней и осенней нерестовых миграций. От этих рыб были добыты антигены (сыворотки крови) и путем иммунизации кроликов были получены 44 иммунные сыворотки.
Для анализа полученного материала применили реакции кольцепреципитации с цельными и истощенными антисыворотками, преципитации на агаровых пластинках по методу Оухтерлони и реакцию связывания комплемента (РСК).
Методом электрофореза на бумаге было исследовано 28 сывороток крови севрюги и 25 сывороток крови осетра.
При исследовании были поставлены следующие задачи:
выяснить наличие антигенных различий сывороточных белков у локальных стад отдельных видов осетровых и изучить степень обособленности этих стад;
выяснить наличие антигенных различий сывороточных белков у биологических групп в пределах каждого локального стада и степень обособленности их между собой;
выяснить наличие или отсутствие внутривидовых различий! в составе белковых фракций сыворотки крови локальных стад и биологических групп у осетра и севрюги.
В результате проведенных работ удалось показать, что между отдельными локальными стадами имеются определенные различия, свидетельствующие о наличии антигенной разнокачественности их сывороточных белков. Эти особенности выявились как в реакции кольцепреципитации, так и в РСК, причем данные обеих реакций полностью совпадали. Антигенные различия у отдельных стад выявлялись не только при реакции с антигеном, которым пользовались для получения данной антисыворотки, но и с другими аналогичными антигенами от рыб того же стада.
Разумеется, реакции не во всех случаях выражены одинаково, что легко объяснить особенностями антисывороток, титры которых могут отличаться в зависимости от свойств продуцента. В отличие от кольцепреципитации и РСК реакция преципитации в агаре не дала ясных различий.
Иммуносерологический анализ различных стад осетров показал наибольшую степень родства между волжским и терским и между куринским и сулакским стадами. Самурское стадо занимает промежуточное положение, но ближе стоит к волжско-терской группе (рис. 19 и 20).
Наличие антигенных особенностей установлено и для локальных стад севрюги, входящих в те же реки (рис. 21 и 22).
При этом степень родства между локальными стадами у севрюг выражена в ином виде, чем у осетра. Куринское и терское стада проявили признаки большей близости, чем соответствующие стада осетров.
И для осетров, и для севрюг было лишь по одному случаю, когда один из антигенов проявил в обеих реакциях свойства, отличные от антигенов других рыб того же стада. Вероятно, такое явление связано с тем, что единичные экземпляры осетровых рыб заходят на нерест в необычную для них реку.
При иммуносерологическом сопоставлении биологических групп внутри одного и того же локального стада осетров и севрюг их антигенные свойства оказались совершенно тождественными (следует иметь в виду, что материал для анализов был взят лишь по I и IV биологическим группам).
По данным И. А. Баранниковой (1955), I биологическая группа по гистофизиологическим и биологическим признакам более близка к IV, чем ко II и III биологическим группам.
Осетровые антигены
Рис. 19. Результаты реакции связывания комплемента между антисыворотками и антигенами различных локальных стад осетров. Осетровая антисыворотка:
1—куринская; 2—волжская; 3—терская; 4—самурская; 5 — сулакская.
Осетровые антисыворотки
Рис. 20. Результаты реакции кольцепреципитации между антисыворотками и антигенами различных локальных стад осетров. Осетровый антиген:
1 — куринский; 2 — волжский; 3 — терский; 4 — самурский; 5 — сулакский.
Очевидно, дифференциация I и IV биологических групп находится лишь в зачаточном состоянии, когда антигенные различия полков, затрагивающие наследственную основу более глубоко, пне не успели установиться.
Электрофоретический анализ сыворотки крови осетра и севрюги показал наличие четырех основных белковых фракций — альбуминов, альфа-, бета- и гаммаглобулинов.
Рис. 21. Результаты реакции связывания комплемента между антисывороткой и антигеном различных локальных стад севрюг. Севрюжья антисыворотка:
1—куринская; 2— волжская; 3—терская; 4—сулакская; 5 — самурская.
Севрюжьи антисыворотки
Рис. 22. Результаты реакции кольцепреципитации между антисыворотками и антигенами различных локальных стад севрюг. Севрюжий антиген:
1—куринский; 2— волжский; 3— терский; 4—сулакский; 5 — самурский.
Сравнительный анализ отдельных белковых фракций сыворотки крови осетра и севрюги внутривидовых локальных стад показал отсутствие существенных различий между последними, а между внутривидовыми биологическими группами в пределах одного стада наблюдались значительные сезонные различия.
При этом процентное содержание гаммаглобулинов у осенних рыб оказалось во всех случаях выше, чем у весенних. Очевидно, соотношение белковых фракций у осетровых—признак более лабильный, чем антигенные свойства, и может подвергаться изменениям в зависимости от- экологической ситуации. Антигенные свойства не обнаружили изменений в зависимости от возраста, пола рыбы, сезона и пр.
Вышеописанные опыты показывают, что комплекс иммуно-биохимических методов имеет очень большое значение в изучении характера внутривидовой дифференциации у рыб, а также в анализе сезонной динамики некоторых биологических показателей.
Следует отметить, что иммунитет рыб — один из наименее изученных разделов сравнительной иммунологии. Он представляет большой интерес не только при изучении родственных связей, но и для понимания эволюции механизмов защиты организма от заразных, болезней, а также для распознавания и предупреждения их.
Для диагностики краснухи карпов Г. Д. Гончаров (1949, 1950, 1951 а, 1959) применил одну из иммуносерологических реакций — реакцию агглютинации, в результате чего была подтверждена вирусная природа этой болезни. Помимо того, он (19516, 1962) проводил активную искусственную иммунизацию карповых рыб против краснухи.
При помощи реакции титрования комплемента В. И. Лукьяненко и Е. К. Миэсерова (1962) проводили сравнительно-иммунологическое изучение комплементарной функции крови четырех видов рыб. Им удалось обнаружить наличие резких различий комплементарной активности сыворотки не только у различных видов рыб, но и у отдельных представителей одного вида.
Однако необходимо отметить, что иммунологические методы в этой области пока еще применяются недостаточно.
Дальнейшее изучение этих вопросов поможет установить важнейшие закономерности сравнительной иммунобиологии, имеющей большое общебиологическое и эволюционное значение.
Проблемы иммунитета рыб в связи с перспективами развития рыбного хозяйства во внутренних водоемах имеют большое практическое значение.