7. Первичная структура белков. Гидролиз белков, определение аминокислотного состава. Анализ n- и c- концевых аминокислот.

Первичная структура- порядок, последов-ость распол-ния аминокис-х остатков в полипептидной цепи. Зная первичную струк-ру можно написать структ-ю формулу моле-лы . Для определ-я структ-ы молекулы белка состоя-й из неско-их полипепти-ых цепей( связ-х дисульфидными связями и нековалент-х взаимодейс-й) необходимо разъед-ть эти цепи и связи. Нековалентные связи с помощью денатурирующих агентов( раст-р мочевины). Дисульфид-е связи путём окисле-я или востановл-я( надмуравьинная кис-та) обр-ся своб-е полипептиды содер-е остатки цистеиновой кислоты или цистеин. Для определ-я перви-й струк-ы отдельной, химически гомогенной полипепти-й цепи методом гидролиза выясня-ся соотноше-е каждой из 20 аминок-т, затем опред-т хим-ая природа концевых аминок-т, содер-ие одну своб-ю NH₂-группу и одну свободную СООН-группу. Гидролиз белков — это необрат-ое разруш-ие перв-ой струк-ы в кислом или щелочном раст-ре с образо-ем аминок-т. Анализ-я продукты гидролиза, можно установить количеств-й сос-в белков. Полный гидролиз белка до аминок-т м. б. осущест-ен только смесью нескол-х ферм-ов. Выд-т 2 группы ферментов: протеиназы( пепсин, трипсин и химотрипсин) гидролизующие природ-е белки до больших пептидов, и пептидазы( карбоксипептидазы, аминопептидазы и дипептидазы, )гидролизую-е пептиды до аминок-т. После полного гидролиза белка произво-я количеств-е опред-ие каждой из аминок-т, присутству-х в гидролизате. Коли-во каждой из аминок-т в данном белке опред-ют, нагревая отдель-е фракции аминоки-т с нингидрином, образу-м соедин-е красно-фиолетового цвета. Интенси-ть окраски в пробе пропорци-а колич-у находящ-я в ней аминоки-ы( на спектрофотометре опред-т количе-во поглощ-го света раствора). N-концевую аминоки-у опреде-ют:1. Методом- Сэнджера основан-й на реа-ии арилирования полипептида 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ), что приводит к образов-ю окраше-го в желтый цвет 2,4-динитрофенильного произв-го N-концевой аминок-ы. Её индифицир-ю мето-м хромотогр-ии.; 2. метод Эдмана- Фенилизотиоцианат реагирует со свободной α-NH2-группой N-концевой аминок-ы полипептида с образ-ем фенилтиокарбамоилпептида, его обработка кисл-ой приводит к циклизации и освобожд-ию фенилтиогидантоина N-концевой амин-ы, природу устанавли-ют хроматографически. Метод Эдмана исполь-ся в качестве хим-ой основы для опреде-я первичной струк-ы белков и пептидов. Опред-ие С-концевой амикосл-ты. Фермент-ые методы: обраб-ка карбоксипептидазой- разрывает пептидную связь там где содерж-я свободная СООН-группа, природа кот-й опред-ся хромотографией; .Метод Акабори. Исполь-ся гидразин. Он расщепляет пептидные связи , не нарушая последова-сть аминок-т в пептиде. Эту аминок-ту опреде-ют с помощью ФДНБ.

8. Вторичная структура белков: элементы вторичной структуры. Строение и функциональная роль доменов.

Вторичн.стр-ра белков - конфигурация полипептид-й цепи, т. е. способ свертыв-я, скручив-я (складывание, упаковка) полипептид-й цепи в спирал-ю или какую-либо др.конформацию. Осн-е эл-ты вторичной стр-ры.А)а-спираль-наибол-е распрстр-на правая а-спираль. Это а-спираль, стабилизируемая множ-м водород.связей, возник-х м-ду наход-ся поблизости др.от др. СО- и NH-группами. Атом водорода NH-группы одной аминок-ты образ-т такую связь с атомом кислорода СО-группы др-й аминоки-ты, отстоящей от первой на четыре аминокисл-х остатка. Т. о. аминоки-та 1 оказ-ся связан-й с аминоки-й 5, аминоки-та 2 — с аминоки-й 6 и т. д. Ha кажд.виток прих-ся 3,6 аминокисл-го ост-ка, шаг винта (т.е. минимал-е расст-е м-ду двумя эквивал-ми точками) сост-т 0,54 нм.(полн-ю а-спирал-ю конформ-ю имеет белок кератин. Это структ-й белок волос, шерсти, ногтей, клюва, перьев и рогов). Сущ-т левая а-спираль, но в природе встреч-ся редко, но энергитически возможна. Стабильность вторичн.стр-ры обеспеч-ся в основ-м водород-ми связями (слабое электростат-е притяж-е м-ду одним ЭО атомом(кисл-д) и водород-м атомом, ковал-но связ-м со вторым ЭО атомом). Б) Бета-стр-ра(стр-ра складч-го слоя)- тип конфигур-и полипт-х цепей, обнаруж-х в белках волос, шелка, мышц и дрх фибр-х бел-х. В этом случае 2 или более линейные полипт-е цепи, располож-е паралельно(в одном напр-и) или, чаще антипаралельно(ориентир-на в противополож-х напр-х), прочно связ-ся межцепочечн-ми водородн.связями м-ду NH и CO группами сосед-х цепей. Г)бета-петля- нах-ся в тех уч-х, где пептидная цепь изгиб-ся достаточно круто. Это корот-й фрагмент, в кот-м 4 аминокисл-х ост-ка располож-ны, т.о. что цепь дел-т поворот на 180 град-в. Домены: В природе сущ-т белки, стр-е кот-х, не соотв-т ни бета-ни альфа стр-ре,напр. коллаген-фибриллярный белок, сост-й осн-ю массу соед-й ткани в организме чел-ка и жив-х. Это такая структурн.организ-я, кот-я нах-ся м-ду вторичн. и третичн.стр-й, это так наз-е надвторичные стр-ры и домены. Надвторичн.стр-ры предст-т собой агрегаты полипт-х цепей, облад-х сообств-й вторичн-й стр-й и образ-ся в нек-х белках в рез-те их термодинам-й или кинетич-й стабил-ти. Домен-это компактная глобулярн.структурн.еденица внутри полиптидн.цепи. Домены могут выполнять разл-е фу-и и подв-ся свертыванию в независимые компактные глобулярные еденицы, соед-е м-ду собой гибкими уч-ми внутри белковой мол-лы.Домены созд-я чередование альфа-спиралей и бета-слоев. Открыто много белков (напр.иммуноглобулины), сост-х из разных по стр-ре и функциям доменов, кодируемых разными генами.

9.Третичная структура. Фолдинг Бе. Шапероны. Глобулярные и фибриллярные Бе. Третичная структ.-это пространственная ориентация полипептид-й спирали.Трет-я стр-ра формир-я самопроизвол-о,основной движущей силой явл. Взаимодействие радикалов АК с мол-ми воды, в результате образуется термически устойчивая форма мол-лы, кот. Хар-ся наименшим кол-ом свобод. энергии.Есть 2 конформации 3-ой стр. : T-форма(напряженная)и R-форма(расслабленая).3-я стр. содержит информацию кот. Определяет все биологич св-ва.Связи, стабилизирующие третичную структуру, могут быть ковалентными (дисульфидными), ионными, вандерваальсовыми и водородными. Процесс сворачивания полипепт цепи в правильную пространственную стру-ру -фолдинг Бе. многих белков, имеющих высокую молекулярную массу и сложную пространственную структуру, фолдинг протекает при участии специальной группы Бе-шапероны.В соотв с молекулярной массой шапероны раздел на 6 основных групп:высокомолекулярные, с молек массой 100-110 кД;Ш-90 - с молек массой 83-90 кД;Ш-70 - с молек массой 66-78 кД;Ш-60;Ш-40;низкомолек шапероны с молек массой 15-30 кД. При синтезе белков N-концевая область полипептида синтезируется раньше, чем С-концевая область. Для фор-ния конформации Бе нужна его полная аминок-л последовательность. Поэтому в период синтеза Бе на рибосоме защиту реакционно-способных радикалов осущ-ют Ш-70.Ш-70 - высококонсервативный класс Бе, кот прису-ет во всех отделах кл: цитоплазме, ядре, ЭР, митохондриях. В обл карбоксильного конца единств полипептидной цепи шаперонов есть участок, обр-ный радикалами аминокислот в форме бороздки. Он способен взаимодействовать с участками белковых молекул и развёрнутых полипептидных цепей длиной в 7-9 аминокислот, обогащённых гидрофобными R. В синтезирующейся полипептидной цепи такие участки встречают примерно через каждые 16 аминокислот.Фолдинг многих высокомолек Бе, имеющих сложную конформацию, осуществляется в спец пространстве, сформированном Ш-60. Ш-60 функ-ют в виде олигомернoго комплекса, состоящего из 14 субъединиц.Ш-60 образуют 2 кольца, каждое из которых состоит из 7 субъединиц, соединённых друг с другом.Шапероновый комплекс имеет высокое сродство к Бе, на поверхности кот есть элементы, хар-ные для несвёрнутых молекул .В специфич среде этой полости, в изоляции от др молекул кл происходит перебор возможных конформации Бе, пока не будет найдена единственная, энергетически наиболее выгодная конформация.Фибриллярные белки — Бе, им-щие вытянутую нитевидную структуру, в кот от-ние поперечной оси к продольной больше 1:10. Большинство фибриллярных Бе не раст-ся в воде, имеет большую молек массу и высоко регулярную пространственную стр-ру, кот стабилизируется, г о, взаимодействиями между различными полипеп-ми цепями. К фибрилБе относят:α-структурные фибрил Бе (кератины,тропомиозин, белки промежут филаментов),β-структурные фибриллярные белки,коллаген . Глобулярные белки́ — Бе, в молекулах кот полипептидные цепи плотно свёрнуты в компактные шарообраз структуры — глобулы (третичные структуры Бе).Глобулярная стр-ра Бе обусловлена гидрофобно-гидрофильными взаим-ми. К глобулярным Бе относятся ферменты, иммуноглобулины, нек гормоны Бе природы,другие Бе, выполняющие транспортные, регуляторные и вспомогат ф-ии.