5.Методы очистки и идентификации белков

Белковые в-ва очень чувств-ны к повыш-ию t и действию многих хим-их реаг-тов (орган-ие раствор-ли,к-ты, щелочи). Поэтому обычные методы орг-ой химии, прим-ые для выд-ия того или иного в-ва из смеси (нагрев-ие,перегонка, возгонка, кристал-ция и др.), в этом случае неприемлемы.Белки в этих усл-ях подверг-ся денат-ции, т.е. теряют нек-ые существ-ые прир-ые (нативные) св-ва, в частности раствор-сть, биол-ую актив-сть. Разраб-ны эффект-ые методы выдел-ия белков в «мягких» усл-ях, при низкой t (не выше 4°С), с прим-ем щадящих нативную стр-ру хим-их реаг-ов. 1.Гомогенизация биол-го матер-ла Перед выдел-ем белков из биол-их объектов (органы и ткани жив-ых, микроорг-мы, раст-ия) исслед-ый материал измел-ют до гомоген-го сост-ия, т.е. подверг-ют дезинтеграции вплоть до разруш-ия клет-ой стр-ры. Эту процед-ру, назыв-ую гомоген-цией, проводят при помощи ножевых гомогенизаторов типа Уорринга или пестикового гомогенизатора Поттера–Эльвегейма. Для выд-ия ряда белков из жив-ых и раст-ых объектов исп-ют валковые или шаровые мельницы. Прим-я еще метод попеременного замораж-ия и оттаивания ткани, в основе действия кот-го лежит разруш-ие клет-й обол-ки, вызванное кристаллами льда. Для дезинтеграции тканей исп-ют ультразвук, пресс-методы и метод «азотной бомбы», при кот-ом кл-ки ( микробные) сначала насыщают N₂ под высоким давл-ем, затем сбрасывают давл-ие – выдел-йся газообр-ый N₂ как бы «взрывает» кл-ки. 2.Экстракция белков При экстр-ции белков прим-ют буфер-ые смеси с опред-ми знач-ями рН, орг-ие раст-ли и неион-ые детергенты –в-ва, разруш-щие гидрофоб-ые взаимод-ия между бел-ми и липид-ми и между белк-ми мол-лами. Из орг-их соед-ий исп-ют слабые р-ры сахарозы. На раств-сть белков при экстр-ции влияние оказ-ет рН, поэтому в бел-ой химии прим-ют фосфатные, цитратные, боратные буферные смеси со знач-ми рН от кис-ых до слабощел-ых, кот-ые способ-ют как раствор-ию, так и стабил-ции белков. Широкое распростр-ие пол-ли трис-буферные системы, предст-щие собой смеси 0,2 М раствора трис-(оксиметил)-аминометана (HOCH2)3CNH2 с 0,1 М р-ром HCl в разных соотн-ях. Для выд-ия белков сыворотки крови исп-ют способы их осажд-ия этанолом ,ацетоном, бутанолом . Почти все орг-ие раств-ли разрыв-ют белок-липидные связи, способствуя лучшей экстр-ции белков. Для освобо-ия белков (ферм-ов), прочно связ-ых с биомембранами митох-рий или др-их субклет-ых стр-р, прим-ют детергенты: тритон Х-100, додецилсульфат натрия и дезоксихолат натрия. Важно знать, что детергенты разр-ют олигомерную (4-ую) стр-ру белков. 3.Фракцион-ие и очистка белков.

После экстр-ции белков, т.е. перевода белков в раствор-ое сост-ие, приступ-ют к раздел-ию – фракцион-ию смеси белков на индивид-ые белки. Для этого прим-ют разн-ые методы: высалив-ие, тепловую денатур-цию, осажд-ие орган-ми раств-лями, хроматографию, электрофорез, распред-ие в 2-хфазных системах, кристал-цию и др.

*Высаливание:

При добавл-ии р-ров солей щел-ых и щелочноземел-ых Ме происх-ит осажд-ие белков из р-ра. Высал-ем белков обычно пол-ся в при анализе белков сыворотки крови и других биол-их жид-стей, и еще в препаративной энзимологии для предварит-го осажд-ия и удал-ия балластных белков или выд-ия исслед-го фермента. Разл-ые белки высал-ся из р-ров при разных конц-циях нейтр-ных р-ров сульфата аммония.На величину высал-ия белков оказ-ют влияние не только природа и конц-ция соли, но и рН среды и t. Считают, что главную роль при этом играет валентность ионов. Раздел-ие белков плазмы крови чел-ка на фракции достиг-ся при исп-ии разл-ых конц-ций этанола при низкой t (от –3 до –5°С) по методу Кона. В этих усл-ях белки сохр-ют свои нативные св-ва.

*Хроматография:

Принцип хром-фии основан на спос-сти пигментов (или любых др-их окраш-ых и неокраш-ых в-в) специф-ки адсорбир-ся на адсорбенте, заключ-ом в колонке.В рез-те происх-ит раздел-ие анализ-ых в-в и их концентр-ие в строго опред-ом слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, кот-ые ослабл-ют силы адсорбции и выносят с током раствора индивид-ые в-ва. Последние послед-но соб-ют в коллекторе фракций (принцип сорбции-десорбции). Эффект-ым ср-вом фракц-ия белков из смеси оказ-сь колоночная хром-фия с гидроксилапатитом, разл-ми ионообмен-ми смолами и произв-ми целллюлозы в кач-ве носителей. При выд-нии и очистке белков исп-ют 4 осн-ых типа хром-фии: адсорбц-ую, распредел-ую, ионообмен-ую и аффинную (хром-фия по сродству).

- Адсорбционная хроматография. Раздел-ие комп-ов смеси основ-но на их разл-ой сорбир-сти на тве-ом адсорбенте.В кач-ве адсор-ов исп-ют активир-ый древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния.

- Распределительная хроматография. Здесь тв-ая фаза служит только опорой (основой) для стацион-ой жидкой фазы. Один из типов распредел-ой хром-фии осущ-ся на колонках, в кот-ых в кач-ве стац-ой фазы прим-ют влажный крахмал или силикагель. Образец раств-ют в подходящем раствор-ле, затем наносят на колонку; раздел-ые в-ва,подверг-щиеся многократ-му распред-ию между неподвиж-ой стац-ой фазой (водный слой) и движ-йся фазой орган-го раств-ля, с разной скор-стью перем-ся ко дну колонки. Собран-ые при помощи коллектора фракции пробы, сод-щие одно в-о,соед-ют для выд-ия этого в-ва в чистом виде. Разновид-стью распред-ной хром-фии явл-ся хром-фия на бумаге, широко исп-мая в биохим-их лабор-ях,в том числе клинич-их, для раздел-ия пептидов,а минок-т и др-их в-в.

- Ионообменная хром-фия. Ионообм-ые смолы явл-ся полимер-ми орг-ми соед-ями, сод-щими функци-ые группы, способ-ые вовлек-ся в ионный обмен. Разл-ют «» +заряж-ые анионообменники, предст-ые орг-ми основаниями и аминами, и «-» заряж-ые катионообменники, сод-щие фенольные, сульфо- или карбоксил-ые группы. В зав-сти от заряда раздел-ых белков исп-ют подход-щую ионообм-ую смолу, с функц-ыми группами кот-ой обмен-ся и задерж-ся на колонке часть белков ,а др-ие белки элюируются с колонки. «Осажд-ые» на колонке белки снимают с колонки, применяя более концентр-ые солевые р-ры или изменяя рН элюента. Нов-ые методы ионообм-ой хром-фии, в частности высокоэфф-ая жид-стная хром-фия (ВЭЖХ), исп-ся в фармакологии (при созд-ии и опред-ии лек-ых в-в),в клинич-ой биохимии (при опр-ии биоло-ски активных в-в в физиолог-их жид-стях), в биотехнол-их пр-сах и произв-вах и др-их областях: они позвол-ют опред-ть в-ва в нано-,пико- кол-вах. - Аффинная хром-фия (хроматография по сродству). Осн-на на принципе избират-го взаимод-ия белков (или др-их макромол-л) с закрепл-ыми (иммобилизов-ми) на носителе специф-ми в-вами – лигандами, кот-ми могут быть субстраты или коферменты (когда выд-ют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д. Достоин-вом метода явл-ся возм-сть одноэтапно выд-ть заданный белок или другой биополимер высокой степени чистоты. При помощи этой хром-фии, например, удалось сравнит-но легко выд-ть очищ-ые препараты аминоацил-тРНК-синтетаз на полиакрилгидразидагаровом геле, к кот-му в кач-ве лигандов были присоед-ны опред-ые тРНК .

- Гель-хроматография. При очистке белков от примесей, исп-ют метод молекул-ых сит, или гель-хром-фию. Раздел-ие в-в этим методом основано на том, что большие мол-лы не прон-ют во внутр-юю водную фазу геля, явл-щуюся стацион-ой, и ост-ся снаружи, двигаясь вместе с подвиж-ой фазой вниз вдоль колонки; небол-ие мол-лы, напротив, свободно диффундируют внутрь зерен, образуя равновес-ую систему между подвиж-ой и стацион-ой фазами, и соответств-но с меньшей скоростью двиг-ся вдоль колонки. Метод нашел широкое прим-ие в препарат-ой энзимологии. С помощью сефадекса(крупные гидрофил-ые зерен, нераств-ые в воде) можно разд-ть белки с разной молек-ой массой.

*Электрофорез.

Метод свобод-го электроф-за основан на различии в скорости движ-ия (подвиж-сти) белков в электр-ом поле, кот-ая опред-ся величиной заряда белка при опред-ых знач-ях рН и ионной силы р-ра. Более широкое распрост-ие пол-ли методы зонального электр-за белков на разл-ых носит-лях, в частности на тв-ых поддерж-ющих средах: гелях крахмала и полиакриламида, целлюлозе. Преимущ-ва их с методом свобод-о электр-за сост-т в том, что искл-ся размывание границы белок-раств-ь в рез-те диффузии и конвекции, не треб-ся налаж-ия сложной аппаратуры для опред-ния полож-ия границы, а для анализа необх-мо небол-ое кол-во белка Одним из наиб-ее распрост-ых методов фракц-ия белков явл-ся диск- в полиакриламидном геле, при кот-ом исп-ют пары буферных р-ров с разл-ми знач-ми рН и разной степени пористости гель.Перспек-ми методами разд-ия оказ-сь разные варианты метода изоэлектр-го фокусирования – изотахофореза, основ-ые на проведении электр-за в поддерж-щих средах с градиентом рН. В последние годы широкое распрост-ие для фракцион-ия белков пол-ли разл-ые сочетания изоэлектрофокусирования и диск-электрофореза в полиакриламидном геле – методы двухмерного элект-за, кот-ые позв-ют паралл-но анализ-ть сотни и даже тысячи белк-х фракций.