Визначення вмісту каротиноїдів

Метод базується на екстракції каротиноїдів із проби чи осаду, попередньо отриманого шляхом обробки проби розчинами Карреза І та Карреза ІІ, наступним очищенням виділеного препарату петролейним ефіром та спектрофотометричним визначенням масової концентрації каротиноїдів.

Реактиви:

- Спирт етиловий С₂Н₅ОН

- Ефір петролейний з температурою кипіння 70-90°С

- Калій залізосиньородистий 3-водневий (розчин Карреза І)

- Цинк сірчанокислий 7-водневий (розчин Карреза ІІ)

- Натрій сульфат Na₂SO₄

0,1 – 1 г дослідної речовини вносили у пробірку для центрифугування, додавали дистильовану воду до об’єму 10 см³, ретельно перемішували скляною паличкою. До проби додавали по 0,1 см³ розчину Карреза І та Карреза ІІ, перемішували і витримували 2 хв при кімнатній температурі. Вміст пробірки центрифугували протягом 5 хв.

До осаду додавали 4 см³ ацетону, ретельно перемішували вміст скляною паличкою протягом 3 хв. Проводили центрифугування екстракту протягом 5 хв, потім відділяли надосадову рідину і кількісно переносили її у ділильну воронку місткістю 25 см³. Осад у пробірці послідовно промивали трьома порціями ацетону по 2,5 см³, кожен раз центрифугуючи для розділення осаду та екстракту. Фракції екстракту збирали у ділильну воронку. Загальний екстракт у ділильній воронці використовували для очищення органічної фази за допомогою петролейного ефіру.

Для проведення очищення екстракту у ділильну воронку 5 см³ петролейного ефіру, вміст воронки перемішували і витримували протягом короткого часу для формування верхнього шару органічної фази. Із воронки видаляли верхню фазу екстракту. У воронку вносили 5 см³ дистильованої води для промивання органічної фази. Вміст воронки перемішували легким струшуванням. Після витримування водну фазу видаляли із воронки.

Органічну (петролейну) фазу кількісно переносили із ділильної воронки у пробірку для центрифугування. У пробірку додавли 0,2 г сірчанокислого натрію, вміст ретельно перемішували, потім центрифугували для відділення петролейної фази від осаду. Після центрифугування петролейну фазу переносили у мірну колбу місткістю 10 см³. До осаду в пробірці для центрифугування додавали 3 см³ петролейного ефіру, перемішували та повторно центрифугували. Потім відділяли петролейну фазу і додавали її до першої порції у мірній колбі. Об’єм екстракту у мірній колбі доводили до мітки петролейним ефіром. Отриманий екстракт використовували для спектрофотометричного визначення загальних каротиноїдів.

Оптичну щільність екстракту вимірюють при 450 нм на спектрофотометрі у кюветі із оптичного скла і довжиною оптичного шляху 1 см. В якості контролю використовували петролейний ефір.

Розрахунок проводили за формулою: ;

А – величина оптичної щільності;

V – об’єм екстракту в петролейному ефірі, мл;

m – маса проби, г.

Визначення вмісту тбк – активних продуктів

При високій температурі в кислому середовищі малоновий альдегід реагує з 2 – тіобарбітуровою кислотою, утворюючи забарвлений триметиловий комплекс з максимумом поглинання 532 нм.

Реактиви:

17% ТХО

0,8% ТБК

Буферний розчин рН 7,4

0,3 мл попередньо гомогенізованої у фосфатному буфері артемії вносили у пробірки і розводили дистильованою водою до 1,5 мл. До утвореного гемолізату додавали 0,4 мл ТХО, після чого центрифугували 10 хв при 4000 об/хв. Надосадову рідину по 2 мл переносили в пробірки, додавали по 1 мл водного розчину ТБК і ставили проби на 10 хв в киплячу водяну баню. В якості контролю використовували проби, що містили замість надосадової рідини буферний розчин рН 7,4. Після появи рожевого забарвлення проби охолоджували до кімнатної температури і вимірювали оптичну густину при 532 нм проти контролю в кюветі товщиною 0,5 мм.

Розрахунок проводили за формулою: ;

D – величина оптичної щільності;

V_кін. – об’єм гомогенату, мл;

l – довжина оптичного шляху, см;

V_пр. – об’єм внесеної проби, мл;

Е – коефіцієнт молярної екстинції (1,56×10⁵ М^-1см^-1).