Биологические методы определения стг: новые перспективы

В работе, опубликованной Росволлом (Roswall et al., 1996), проведено тщательное сравнение двух новых биологических методов определения СТГ, разработанных в лабораториях авторов, и теста на увеличение массы тела крыс с удаленным гипофизом. Чтобы в полной мере оценить принципы, положенные в основу этих новых методов, необходимо рассмотреть: а) особенности строения молекулы СТГ, полученной генно-инженерным путем (рекомбинантный гормон роста человека, рчСТГ); б) его структурные варианты и продукты деградации; в) молекулярные взаимодействия между этими хорошо изученными формами и рецептором СТГ человека.

Первичная структура рекомбинантного соматотропного гормона человека и ее молекулярные особенности

Первичная последовательность формы рекомбинантного гормона роста человека, состоящая из 191 аминокислотного остатка (22 кДа). Эта форма идентична природной молекуле СТГ с мол. массой 22 кДа, которая синтезируется в гипофизе и выделяется в кровеносное русло при физиологической потребности. Отличительной структурной особенностью является положение остатков цистеина, отвечающих за формирование большой внутренней дисульфидной петли и меньшей по размеру петли на конце с-белка. Показаны также сайты ферментативного расщепления, расположенные между остатками треонина-136 и тирозина-143. Расщепление пептидной молекулы в этом месте приводит к образованию структуры, состоящей из двух цепей, связанных дисульфидными мостиками. Формирование такой двухцепочечной формы может происходить при участии мембран-ассоциированной протеазы во время секреции гормона клетками гипофиза. При длительном хранении СТГ в растворе может происходить дезамидирование остатков аспарагина 149 и 152, а также потеря крайних двух остатков на N-конце.

В биологических образцах обнаруживаются различные структурные варианты СТГ. В своих исследованиях Росволл с коллегами (Roswall et al., 1996) получили два варианта из встречающихся в природе, используя как исходную основу рекомбинантный гормон роста. Один из этих вариантов был димер, образовавшийся в результате формирования ковалентной связи между остатками метионина, другой — транскрипционный вариант с мол. массой 20 кДа, образующийся в результате делеции остатков 32— 46. Эти варианты были использованы в исследованиях, которые рассмотрены ниже.

Знание особенностей взаимодействия молекул рекомбинантного гормона роста с мембранными тканевыми рецепторами СТГ имеет немаловажное значение для более глубокого понимания значения и физиологических последствий повышения уровня СТГ в крови в ответ на занятия физическими упражнениями. Исследования Каннингэма и его коллег позволили более 15 лет назад не только установить полную аминокислотную последовательность мембранного рецептора соматотропина, но и показали, что внеклеточный компонент почти идентичен гликозилированной форме рецептора, выделенного из сыворотки человека (Cunningham, Wells, 1989; Cunningham et al., 1991). Эти исследователи доказали, что одна молекула СТГ с мол. массой 22 кДа образует комплекс с внеклеточными рецепторами двух молекул рецептора СТГ. При низких концентрациях СТГ рецептор связывается с двумя различными участками на поверхности молекулы гормона.

Знание молекулярных основ этого физиологического взаимодействия позволило Росволу (Roswall et al., 1996) разработать два различных типа биологических методов определения СТГ. Один, который носит название высокоэффективная рецепторсвязывающая хроматография (high performance receptor binding chromatography, HPRBC), заключается в сравнении в способности исследуемого образца СТГ и стандартного образца рСТГ формировать стабильный комплекс 2:1 рецептор/СТГ с растворимым рецептором СТГ. Для анализа полученного комплекса использовали эксклюзионную хроматографию в неденатурирующих условиях. Страсбургер с коллегами недавно разработали метод иммуно-функционального иммуноанализа со связанным ферментом (ИФА), который основан на более ранних работах Каннингама и его коллег (Strasburger et al., 1996). В этом методе для оценки функциональной активности препаратов, содержащих гормон роста, используют моноклональные антитела к СТГ и биотинилированный СТГ-связывающий белок. ИФА также применялся для определения содержания соматотропина в системе кровообращения после занятий физическими упражнениями (Nindl et al., 2000).

Второй метод, предложенный Росволлом (Roswall et al., 1996), носит название тест клеточной пролиферации (cell proliferation assay, СР) и состоит в том, что клетки клеточной линии миелоидной лейкемии мыши FDC-P1, трансфецированиые полным геном рецептора, инкубировали с исследуемыми образцами, содержащими СТГ, и оценивали как показатель биологической активности пролиферацию клеток по включению 3Н-меченого тимидина в ДНК. Подобный подход был использован для определения активности различных вариантов СТГ с использованием клеток Ba/F3-hGHR (Wada et al., 1998). В этих клеточных тестах проводится оценка ответной реакции (т. е. синтеза ДНК как показателя пролиферативной активности клеток), которая отделена от процесса димеризации рецептора несколькими звеньями сигнальной цепи. Росволл и его коллеги считают, что благодаря этому мы можем стать “еще на несколько шагов ближе к пониманию биологического ответа in vim" (Roswall et al., 1996, p. 36).