Методы анализа

Первые получившие широкое распространение методики скрининга и доказательств для допинг-контроля заключались в приготовлении препаратов проб с использованием жидкостной экстракции мочи, концентрации полученных экстрактов и разделении анализируемых веществ с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) и тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для анализа продуктов, разделенных с помощью ГЖХ, использовали плазменно-ионизационный детектор (ПИД), который позволял обнаружить присутствие стимуляторов из группы амфетамина по сигналу с временем удержания, сопоставимым со стандартными образцами аналогичных препаратов. Тонкослойную хроматографию применяли для идентификации стрихнина и таких стимуляторов с гидроксилированным кольцом, как β-гидроксиамфетамин и фенилэфрин (Beckett et al., 1967). В случае позитивных результатов теста дополнительную информацию об анализируемых веществах получали с помощью дериватизации, микроинфракрасной спектроскопии, а также масс-спектрометрии (МС). Совершенствование аналитических методов и появление различных технических новшеств привело к разработке сложных процедур приготовления образцов и появлению разнообразных видов анализа, и наконец, к созданию и выпуску в продажу специального оборудования, что в целом позволяет проводить обширный анализ образцов мочи элитных спортсменов с целью допинг-контроля. В зависимости от свойств анализируемых веществ применяются различные аналитические инструменты. Принципы работы некоторых из них рассмотрим ниже.

В целом предварительное хроматографическое разделение экстрактов, полученных из биологических материалов, таких, как кровь, моча или волосы является в большей или меньшей степени обязательным условием для последующего аналитического анализа. Это позволяет получить более подробную информацию об анализируемых образцах; например, разница во времени удержания позволяет разделить стереоизомеры, кроме того, так можно отделить вещества, представленные в образце в небольших концентрациях, от тех которые составляют его значительную часть. Современные хроматографические системы основаны на применении капиллярной газовой хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии, оба эти метода чрезвычайно сложны и развились в отдельные разделы аналитической химии.

Газовая хроматография

Сегодня капиллярные колонки представляют собой наиболее распространенное средство для проведения газовой хроматографии (ГХ) с целью допинг-контроля. Их высокая эффективность с точки зрения качества разделения, износоустойчивость и необыкновенное разнообразие неподвижных фаз обеспечивает широкий выбор для создания различных методик и возможности для решения таких задач, как проведение полного анализа или скрининг специфических веществ. Колонка состоит из трех основных элементов: (а) внешнего защитного покрытия; (б) слоя сорбента из плавленого кварца и (в) неподвижной фазы.

Кварцевое покрытие. Сорбирующий слой изготовлен из синтетического кварцеподобного стекла высокой степени чистоты с низким содержанием примесей оксидов металлов. Такое покрытие благодаря наличию групп силанола имеет чрезвычайно активную поверхность, которая может реагировать с полярными группами анализируемых веществ, такими, как гидроксильные, карбоксильные и тиольные остатки, а также первичными и вторичными аминами, что приводит к появлению "хвостов" у пиков разделяемых веществ и снижению интенсивности пиков. Поэтому при подготовке колонки производится деактивация силанольных групп с помощью подходящей химической обработки, например путем триметилсилилирования. Полученное таким образом покрытие хорошо подходит для нанесения неподвижной фазы.

Неподвижная фаза. Неподвижная фаза в газовой хроматографии играет основную роль, поскольку именно она определяет время удержания, качество разделения и форму пиков анализируемых веществ. Эта особая часть капиллярной колонки состоит либо из полисилоксанов/силиконов, полиэтиленгликолей (ПЭГ) либо из пористого слоя сорбента. Чаще всего в качестве неподвижной фазы используют замещенные полисилоксаны, которые обладают высокой стойкостью и сроком службы. Общая химическая структура неподвижных фаз изображена на основе полисилоксанов, которые представляют собой цепочку из чередующихся кислорода и кремния с боковыми замещающими группами, присоединяющимися по две к каждому атому кремния. Структура и количество замещающих групп являются характеристикой каждой неподвижной фазы. Используют преимущественно четыре замещающие группы в разном соотношении: а) метальные; б) фенильные; в) цианопропильные, г) трифторпропильиыс остатки. Выбор замещающих групп и их относительная представленность в неподвижной фазе определяют полярность ГХ колонки. Еще одним материалом, применяемым для формирования неподвижной фазы в ГХ-колонках, является ПЭГ, основной характеристикой которого является молекулярный вес или длина цепей полимера. Существенное отличие этого материала от полисилоксана заключается в возможности создания неподвижных фаз с определенным значением pH, т. е. кислотных или щелочных колонок, которые демонстрируют лучшие показатели при разделении кислотных или щелочных соединений соответственно. Основным недостатком является высокая чувствительность к кислороду, особенно при повышенных температурах, которая приводит к разрушению неподвижной фазы и сокращает срок службы колонки. Неподвижные фазы для адсорбционной хроматографии состоят из мельчайших частичек пористых материалов (например, полимеров, оксида алюминия, молекулярных сит), которые присоединяют к кварцевому покрытию капилляра с помощью химических линкеров. Благодаря высокой адсорбирующей способности в отношении газообразных веществ такие неподвижные фазы используют преимущественно для хроматографии наиболее летучих компонентов или газов, которые обычно плохо связываются с неподвижными фазами на основе полисилоксанов или ПЭГов, поэтому температуры разделения здесь не превышают 35 ’С. В случае применения так называемых капиллярных ГХ колонок PLOT (porous layer open tubular) твердофазная абсорбция газов является основным механизмом разделения, обеспечивающим эффективное удержание летучих веществ. В то же время сильная адсорбция анализируемого вещества на неподвижной фазе не позволяет использовать такие колонки для деления менее летучих веществ.

Внешняя оболочка. Поскольку капилляры из сплавленного кварца очень хрупкие, для них требуется защитное внешнее покрытие. Для этой цели обычно используют полиимид, который обладает двумя достоинствами: во-первых, колонки с полиимидной оболочкой достаточно прочные и не требуют деликатного обращения, во-вторых, полиимид покрывает и заполняет все трещины в капиллярах из сплавленного кварца, предотвращая увеличение дефектов.

После рассмотрения устройства капиллярной колонки для газовой хроматографии следует отметить еще два параметра, оказывающих заметное влияние на качество хроматографического разделения: размеры колонки, т. е. длина, диаметр и толщина пленки неподвижной фазы, а также газы-носители.

Тогда как длина и диаметр колонки влияют в основном на разрешение пиков, толщина пленки неподвижной фазы определяет емкость колонки и удержание анализируемых веществ. Длина колонки прямо пропорциональна количеству теоретических тарелок, а поскольку разрешение пропорционально корню квадратному количества теоретических тарелок, разрешение также будет пропорционально корню квадратному длины колонки. Иными словами, удвоение длины колонки (а значит, и количества теоретических тарелок) будет приводить к улучшению разрешения не на 100 %, а только на 25—35 %; уменьшение длины колонки на 50 % приведет к ухудшению разделения примерно на 15 — 25 %. Кроме того, количество теоретических тарелок обратно пропорционально диаметру колонки, следовательно, уменьшение диаметра колонки будет увеличивать эффективность газовой хроматографии, т. е., поскольку разрешение пропорционально квадратному корню из количества теоретических тарелок, уменьшение диаметра колонки в два раза также позволит улучшить разделение на 25—35 %, как, например, при замене колонки с внутренним диаметром 0,2 мм2 на колонку с диаметром 0,11 мм2. Емкость колонки непосредственно определяется толщиной пленки неподвижной фазы. Если толщина слоя неподвижной фазы 0,1—0,2 мкм подходит для анализа 20—50 нг вещества, то для анализа количеств больше 125 нг необходима колонка с толщиной неподвижной фазы 0,5 мкм, поэтому толщина пленки должна быть подобрана в соответствии с предполагаемым количеством анализируемых веществ, наносимых на ГХ колонку.

Кроме того, на параметры хроматографического разделения влияет также используемый в качестве носителя газ, эта зависимость описывается кривой Ван Деемтера. В качестве газов-носителей часто используют гелий и водород, причем последний обеспечивает превосходную оптимальную линейную скорость, в результате чего значительно улучшается качество разделения. Явный недостаток водорода щ его высокая воспламеняемость.