20.Молекулярные маркеры днк (пдрф, rapd, ssr). Микро- и минисателлиты. Фингерпринтинг как метод идентификации личности.

ДНК-маркеры — особенности нуклеотидной последовательности ДНК, отличающиеся полиморфизмом и тесно связанные с геном, отвечающим за нужный признак.

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, Restriction fragment length polymorphism, RFLP) — это способ исследования геномной ДНК, путем разрезания ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза (ДНК электрофореза).

При использовании данного исследования получаются различные результаты от различных образцов, и при помощи ПДРФ можно идентифицировать некоторые различия в последовательности нуклеотидов ДНК, в случае, когда они располагаются в сайте рестрикции. В виду того, что технологии секвенирования ДНК могут охарактеризовать ДНК очень точно, ПДРФ был разработан как первый и дешевый метод для массового применения. Анализ разнообразия.

Изменчивость размеров фрагментов ДНК, выщепляемых рестриктазами, обусловленная возникновением или изменением в результате мутаций сайтов рестрикции. Анализ ПДРФ позволяет использовать отдельные аллели в качестве популяционных маркёров, а также применять их в пренатальной и обычной диагностике мутаций в генах и определять их локализацию в геноме методом рестрикционного картирования. Анализу и сравнению подлежат гомологичные фрагменты геномной, эписомной и иной ДНК размером до 30—40 тыс. п.о., иногда — до нескольких млн. п. о. При анализе ПДРФ возможно появление большого количества продуктов рестрикции, в связи с чем фрагменты ДНК переносят из геля на твердую подложку и гибридизируют с меченой пробой ДНК, гомологичной тестируемым последовательностям. Гибридизационные фрагменты типируют с помощью радиоавтографии. В качестве гибридизационных проб используют к-ДНК, или фрагменты геномной ДНК с известной функцией, относительно часто используют различные семейства повторяющихся последовательностей ДНК. В случаях, когда эти повторы состоят из простой последовательности — „минисателлитной ДНК“, использование их в качестве зондов для гибридизации позволяет получить высокоспецифическую картину гибридизации геномной ДНК, характерную для конкретной особи. Этот принцип получил название „метода геномной дактилоскопии“ или „фингерпринта“ — отпечатка пальцев. Минисателлитные зонды удобны для маркирования изменчивости генетического материала у разных организмов. ПДРФ эффективен при картировании генома, маркировании генов многих биологических и экономически важных признаков. Использование ПДРФ позволило в короткие сроки существенно заполнить генетические карты различных видов растений и других организмов.

К недостаткам ПДРФ, ограничивающих возможности его применения в исследованиях на популяционном уровне относятся следующие: 1) необходимо обеспечение ДНК-зондами 2) требуется относительно большое количество высокоочищенной ДНК; 3) неполная пенетрантность аллелей, контролирующих признаки продуктивности; 4) наличие изменчивости негенетической природы; 5) трудности локализации аллелей структурного гена.

RAPD (random amplified polymorphic DNA) — произвольно амплифицированная полиморфная ДНК — продукт ПЦР с произвольными праймерами. Праймеры, применяемые для RAPD, имеют относительно небольшие размеры (8—12 нуклеотидов), произвольную нуклеотидную последовательность и [G+C]-состав не ниже 50%. При этом отпадает необходимость выяснения нуклеотидной последовательности амплифицированного участка ДНК, что значительно упрощает анализ. Образцы электрофоретического разделения амплифицированной ДНК (RAPDs) из различных генетических источников могут быть объектом сравнительного анализа, на основании которого определяется уровень генетического сходства.

SSR –маркеры выражены со-доминантно (со-мажорированно), в основном легко вычисляются (записываются) и могут легко наноситься на карту. Они были показаны для состоятельности анализа в разных лабораториях и (уделяя достаточно внимания экспериментальным условиям) являются твердыми и повторяемыми. Кроме того, они могут изучаться, используя автоматические, высоко пропускные, нерадиоактивные ДНК-сиквенсеры (синтезаторы), основанные либо на гелевом, либо на капиллярном электрофорезе, и могут анализироваться одновременно ((уплотненно)мультиплексированно). Для создания SSR подбираются праймеры к уникальным последовательностям ДНК, фланкирующим микросателлитный повтор, что требует предварительного знания их нуклеотидной последовательности. Полиморфизм SSR определяется различной копийностью мономерных единиц в кластере, что приводит к существованию множественных аллельных вариантов. Гетерозиготность их очень высока (часто более 75%).

Микросателлиты (или простые короткие (тандемные) повторы) — варьирующие участки (локусы) в ядерной ДНК и ДНК органелл (митохондрий и пластид), состоящие из повторяющихся фрагментов длиной от 1 до 6 пар оснований. Используются как молекулярные маркеры в определении родства, принадлежности к конкретной популяции, для исследования гибридизации. Также используются для поиска паралогов. Микросателлиты характеризуются высокой скоростью изменения последовательностей, обусловленной «проскальзыванием» при репликации ДНК и точечными мутациями.

Представляют собой одну из разновидностей сателлитной ДНК.

Микросателлитные последовательности небольшой длины, называемые короткими тандемными повторами (2-6 нуклеотидов, от. англ. STR — short tandem repeats), используются при картировании геномов в работе с редкими видами.

Минисателлиты — поворяющиеся фрагменты ДНК длиной от 7 и более нуклеотидов. Являются одной из разновидностей сателлитной ДНК. Они встречаются более чем в 1000 местах генома человека. Используются в качестве ДНК-маркеров. Механизмами происхождения являются "проскальзывания" при репликации ДНК, точечные мутации и рекомбинация.

Судмедэксперты используют ДНК в крови, сперме, коже, слюне или волосах, обнаруженных на месте преступления для обнаружения преступника.

21. Понятие о геномике и протномике Ортологические и паралогические гены.