14. Особенности репликации днк у про – и эукариот. Доказательства полуконсервативного способа репликации днк.

Перед каждым удвоением хромосом и делением клетки происходит репликация (удвоение) ДНК. Репликацией называют процесс самокопирование молекулы ДНК с соблюдением порядка чередования нуклеотидов, присущего материнским комплементарным нитям.

Спиралевидная двухцепочная ДНК сначала расплетается (раскручивается) вдоль оси, водородные связи между азотистыми основаниями рвутся и цепи расходятся. Затем, к каждой цепи пристраиваются комплементарные азотистые основания и образуются две новые дочерние молекулы ДНК. Такой способ удвоения молекул, при котором каждая дочерняя молекула содержит одну материнскую и одну вновь синтезированную цепь, называют полуконсервативным.

Процесс репликации осуществляется с помощью ферментов, которые получили название ДНК-полимераз.

У прокариот реплик-я.Бактер-я хромосома-1 репликон. осуществляется 2 путями: «катящееся кольцо или сигма тип» и тета-тип.

«Сигма тип»В наружной цепи кольцевой ДНК образуется разрыв с помощью эндонуклеазы, узнающей участок ori. При разрыве появляется 3 и 5 концы. 5 конец прикрепяется к клет.мембранеМатеринская кольц.молекула вращ.против час.стрелки, наруж.цепь «сползвет» с неё.форм-ся репликативная вилка. Новая цепьДНК синтез-ся как продолжение внешней,используя в кач-ве матрицы вутр.кольцо. Синтез доч.цепи идёт от 5'->3'(ну клеотиды присоед. К 3 концу матричной ДНК). Разверувшаяся ДНК явл.матрицей для синтеза второй цепи ДНК.Синтез идёт так же5'->3'.Конкатемер-нить,содерж-я несколько повторов одного и того же генома. Из него молекулы, равные по длине хромосомы, вырезаются рестриктазами, узнающими короткие блоки специфических последовательностей ДНК. Этот способ репл. Обусл-ет образ-е многих копий материнской ДНК.

«Тэта-тип»Кольцевая стр-ра сохраняется. От ori в противопол.направлениях движутся 2 реплик-е вилки, пока не встретятся.Движение вилок приводит к образ-ю «глазков», расшир-ся по мере реплик-ии в 2х напр-ях. Промеж. Стр-ра- похожа на тета.из родит-ой кольц.хромосомы форм-ся 2 дочерние кольц-х хромосомы. В каждой сод-ся одна из цепей родит-ой мол-лы, 2-я синт-ся заново.сначала 2-хцепочечные кольц.моллы связаны, при их разделении одно из двух колец временно разрывается.

Репл.вилка-уч-к хромосомы. Где родит-ая двуцеп-ая ДНК расходится, чтобы произошла репл-я.

ДНКгираза удаляет супервитки спирали.Геликаза осущ-т разрыв двуцеп. ДНК по водородым связям. Образовавшаяся одноцеп-яДНК связывается с белками SSB,кот не дают ей сплестись обратно

Для начала репл-ии нужна РНК-полимераза, кот.осущ-ет синтез РНК затравки(праймера) со свободным 3-ОН концом, затем подключается ДНК-полимераза III, кот. Продолжает наращивать цепь.

На одной лидирующей цепи-синтез идёт непрер-но от 5 к 3, а на отстающей тоже от 5к3 ДНК синт-ся фрагментами Оказаки. После ДНК- полимераза I обесп-тзаполнение брешей освоб-ся участков нуклкотидами, комплем-ми ДНК-матрице. Фр.Оказаки сшив-ся ДНК лигазой.

У эукариот.Хромосома полирепликонна.В один момент может по ней может двигаться по неск-ко репл.вилок. Остановка мб при столкновении вилок, при достижении вилкой крца хромосомы. Репл. Осущ-ся в S период клет.цикла. Есть поблема концевой недорепликации.Теломеры,сост. из многократно повт-ся нуклеотидных послед-ей. Связ-х с белками. Теломеры предотвращ. Деград-ю и слияние хромосом. ДНК-полимеразы не спос-ны полн-ю реплиц-ть концы линейых ДНК. В рез-те 5концы ост-ся недорепл-ми.Каждая репл-я хр-м будет приводить к их укорочению.

Теломераза сод-т белки и РНК.РНК служит матрицей д/наращивания ДНК теломерными повторами. Т.о. с пом-ю теломеразы наращся3концы ДНК каждую репл-ю короткими повт-ся послед-ми.

Одним из фундаментальных свойств ДНК, обеспечивающих передачу наследственной информации от клетки к клетке в процессе деления от родителей к потомкам является репликация. Репликация НК обеспечила возможность возникновения жизни и непрерывность живой материи. Предположение о полуконсервативном способе репликации ДНК (т.е новая молекула представлена одной родительской и одной вновь синтезированной цепями) высказано еще Уотсоном и Криком. Первые доказательства получены в 1957г. М.Мезельсоном и Ф.Сталем. Вновь синтезируемые молекулы ДНК метели ¹⁵N. Для этого бактерии E. Coli в течении нескольких делений выращивали на среде с единственным источником азота ¹⁵NH₄Cl (хлорид аммония) Вся ДНК была равномерно помечена ¹⁵N и имела более высокую плотность. Образцы с тяжелой и легкой ДНК легко разделить при центрифугирование в градиенте плотности хлорида цезия, образуя в УФ длиной 160нм 2 зоны поглощения. Если бактерии, выращенные на среде с ¹⁵N переносили в среду с ¹⁴N и давали поделится 1 раз, то экстрагированная из них ДНК давала только 1 зону поглощения в УФ – промежуточную. Это исключало консервативный механизм репликации, при котором новые молекулы не содержат материала родительской ДНК. Если давали поделится на обычной среде 2 раза, то появлялся пик легкой ДНК и сохранялся пик промежуточной, не исчезающей при последующих деления. Хромосома бактерий представляет собой один репликон. Репликон – автономная единица репликации, в пределах которой она начинается и заканчивается. Хромосома эукариот полирепликонна и содержит сотни репликонов. В каждом репликоне присутствуют необходимые для репликации контролирующие элементы: точка инициации origin и точка окончания terminalis.

15. Проявление принципа комплементарности генома в фундаментальных биологических процессах и его использование в экспериментах по молекулярной генетике. Гибридизация in situ. Полимеразная цепная реакция.

Комплементарность - пространственная взаимодополняемость поверхностей молекул или их частей, подходящих как ключ к замку, приводящая к образованию вторичных (например, водородных) связей между ними. Принцип К проявляется в комплексах АГ-АТ, Фермент-Субстрат. Но наиболее ярко выражен в структуре ДНК. Образование водородных связей м/у пуриновыми и пиримидиновами основаниями обусловлено их пространственным соответствием. Пурины – более крупные молекулы, вкл 2 кольца, пиримидины – 1. Пуриновые основания (А, G) не могут составить пары, т.к. им не хватает места в центре спирали. Напротив, пиримидиновые основания (С, Т) слишком малы для образования м/у ними водородных связей. Т.е. пара из двух пуринов была бы слишком велика, а пара из двух пиримидинов – слишком мала для укладки в правильную спираль молекулы ДНК. Именно соединения оснований в пары по принципу К. (А=Т) (G=-С) обеспечивает равную величину ступенек лестницы ДНК. Это и составляет суть принципа К. К азотисты оснований в молекуле ДНК представляет главную сущность молекулярных основ наследственности, т.к. позволяет понять как при делении к-ки синтезируются тождественные молекулы ДНК. Уникальная вторичная и третичная структура тРНК и рРНК также определяется К спариванием оснований с образованием петель и шпилек вдоль цепи. По принципу К происходит узнавание антикодоном тРНК соотв-шего кодона иРНК при транскрипции. Т.о. на принципе К основаны все фундаментальные процессы жизнедеятельности клетки: репликация, транскрипция, трансляция, репарация. Т.е. матричная активность гена базируется на использовании принципа К при считывание и реализации наследственной информации.

Гибридизация in situ: ISH- и FISH- гибридизация

Прямым методом картирования генов на хромосоме является метод гибридизации нуклеиновых кислот. Вариации метода (гибридизация in situ - на месте) и FISH используются в тех случаях, когда имеются пробы, или зонды с известными (секвенированными) нуклеотидными последовательностями. Зонды - это искусственно синтезированные меченые: радиоактивными изотопами или флуоресцентными красителями - химически небольшие (10-30 нуклеогидов) сегменты одноцепочечной ДНК (или РНК), комплементарные искомому гену. Эти короткие олигонуклеотиды соединяются только с тем участком ДНК, который содержит последовательность нуклеотидов, строго соответствующую (комплементарную) последовательности нуклеотидов зонда. Следовательно, наличие связавшейся с ДНК метки с высокой точностью свидетельствует о присутствии в анализируемом образце искомых последовательностей нуклеотидов.

Локусы генов, комплементарные зондам, могут быть картированы непосредственно на хромосоме путем регистрации радиоактивной метки.

Принципы метода ПЦР. Полимеразная цепная реакция имитирует природный процесс воспроизведения (удвоения) ДНК - репликацию, происходящую на матричной основе (по принципу комплементарности) с участием фермента ДНК-полимеразы. Но если во время репликации удваивается вся ДНК, то при ПЦР - происходит многократное копирование (воспроизведение, амплификация) лишь интересующего исследователя специфического, небольшого фрагмента, расположенного между двумя праймерами.

Вкл.3этапа:

1.денатурация ДНК.Кратковременное нагревание приводит к разрушению водородных связей и разъединению цепей ДНК.t=93-95⁰, 30-40сек.

2.Отжиг=присоед-ие праймеров при охлаждении реакционной смеси, комплементарно к соотв-м послед-м на противопол-х цепях ДНК а границах специф-го участка.20-60сек,t=50-60⁰-для каждого праймера по-разному.

3,Синтез ДНК(элонгация).С участием термостабильной ДНК-полимеразы(Taq-полимераза).происх.избирательный синтез уч-каДНК, распол-го м/у праймерами.Амплиф-я происх,если расст-е м/у праймерами 50-4000осн-ия.Синтез ДНК от5к3 в обоих напр-х.Наращивание праймеров навстречу друг другу.20-40сек. t=70-72⁰.

Р-р с копиями опять подогревают д/начала нового цикла.