Результаты

Гибридизация пробы со специфическим участком ДНК, закрепленным на мембране, указывает на наличие анализируемой последовательности нуклеотидов в пробе.

Применение

Саузерн блоттинг, который проводят с геномной ДНК, обработанной эндонуклеазами рестрикции, может быть использован для определения числа копий генов в геноме. Проба, которая гибридизуется только с единственным фрагментом ДНК, который не был разрезан рестриктазами, дает одну полосу на Саузерн-блоте, в то время как множественные полосы на блоте указывают на то, что проба гибридизовалась с несколькими идентичными последовательностями. Изменения условий гибридизации (повышение температуры, при которой проводят гибридизацию, изменение концентрации соли) приводят к повышению специфичности и снижению гибридизации с близкими, но не идентичными последовательностями.

12. Геном человека и методы его изучения. Принципы построения цитологических, генетических и физических карт хромосом. «Прогулка по хромосоме».

Геном – это совокупность генов в гаплоидном наборе хромосом клетки или организма. Генные взаимодействия происходят на уровне макромолекул, реакций метаболизма, процессов онтогенеза, образуя интегрированную систему. В геноме имеется по одной хромосоме из каждой гомологичной пары и по донному гену из каждой пары аллелей.

1. Гибридологический метод - метод скрещивания. Мендель. Можно установить:

доминантен или рецессивен исследуемый признак; генотип организма; взаимодействие генов и характер их взаимодействия; явление сцепления генов; расстояние между генами; сцепление генов с полом.

2. Цитогенетический метод. Изучение количества, формы и размеров хромосом у животных и растений. Используют для выяснения причин заболеваний.

3. Генеалогический метод = метод родословных. Можно установить доминантность и рецессивность признака.

4. Близнецовый метод. Все различия между близнецами обусловлены только внешней средой.

 Цитологические карты -схематическое изображение хромосом с указанием мест фактического размещения отдельных генов, полученное с помощью цитологических методов. Генетические карты хромосом. Каждое место расположения гена (локус) на генетической карте организма, установленное на основе частоты перекреста участков хромосом (Кроссинговера), на Ц. к. х. привязано к определённому, реально существующему участку хромосомы, что служит одним из основных доказательств хромосомной теории наследственности. Для построения Ц. к. х. используют данные анализа хромосомных перестроек (вставки, делеции и др.) и, сопоставляя изменения морфологических признаков хромосом при этих перестройках с изменениями генетических свойств организма, устанавливают место того или иного гена в хромосоме. При цитологическом картировании изучение дифференциально окрашенных хромосом позволяет обнаружить крупные хромосомные перестройки путем сравнения исследуемого образца с контрольным.

Гибридизация in situ: ISH- и FISH- гибридизация

Прямым методом картирования генов на хромосоме является метод гибридизации нуклеиновых кислот. Вариации метода (гибридизация in situ - на месте) и FISH используются в тех случаях, когда имеются пробы, или зонды с известными (секвенированными) нуклеотидными последовательностями. Зонды - это искусственно синтезированные меченые: радиоактивными изотопами или флуоресцентными красителями - химически небольшие (10-30 нуклеогидов) сегменты одноцепочечной ДНК (или РНК), комплементарные искомому гену. Эти короткие олигонуклеотиды соединяются только с тем участком ДНК, который содержит последовательность нуклеотидов, строго соответствующую (комплементарную) последовательности нуклеотидов зонда. Следовательно, наличие связавшейся с ДНК метки с высокой точностью свидетельствует о присутствии в анализируемом образце искомых последовательностей нуклеотидов.

Хромосомный пейнтинг

Одним из наиболее разрешающих методов является многоцветная флуоресцентная гибридизация или хромосомный пейнтинг (хромосомная живопись). Для получения многоцветных изображений используют различные флуорохромы, которыми метят разные зонды ДНК.

Гибридизация соматических клеток

При цитологическом картировании используется также гибридизация соматических теток. В условиях культуры можно получить соматические гибриды клеток человека и различных грызунов: человек - мышь, человек - крыса, человек - хомяк. Так, к 2002 году был полностью изучен геном мыши.

Физическое картирование основано на прямом анализе молекул ДНК составляющих каждую хромосому. Его конечная цель - определение последовательности нуклеотидов в каждой хромосоме. Физическая карта – графическое представление порядка следования физических маркеров (фрагментов молекулы ДНК), расстояние между которыми определяется в парах нуклеотидов. Физические карты целой хромосомы или ее сегмента строятся на основе прямого исследования генетического материала и дают представление о реальном расположении генов в ДНК. Генетические карты показывают линейное расположение маркерных сайтов, расстояние между которыми измеряют в сМ (сантиморган - условная единица частоты рекомбинации).

Рестрикционное картирование основано на установлении точек действия различных рестриктаз. Распределение сайтов рестрикции представляет собой своеобразный паспорт каждого фрагмента ДНК и может использоваться для его идентификации.

Создание упорядоченных библиотек клонов. Карты контиг. Процедура "Прогулка по хромосоме"

Чтобы установить порядок расположения клонов на хромосоме (по ее длине), необходимо выявить участки их частичного перекрывания. Это можно сделать путем гибридизации нуклеиновых кислот, если известна нуклеотидная последовательность хотя бы одного фрагмента. Его метят радиоактивно или флуорохромом и используют в качестве зонда для создания упорядоченных библиотек клонов.

"Прогулка по хромосоме" (скользящее зондирование). Для упорядочивания клонов используют две разные библиотеки геномной ДНК, полученные из ДНК одного и того же организма, но разделенные двумя разными рестриктазами. Если один из генов (или клонов) в первой библиотеке удалось картировать и клонировать, он затем может быть использован в качестве зонда для выявления перекрывающегося клона во второй библиотеке. А изученный клон второй библиотеки может использоваться как зонд для другого перекрывающегося фрагмента первой библиотеки и т.д.

Таким образом устанавливается порядок расположения клонов на хромосоме.