11. Генная инженерия. Особенности трансформации у про- и эукариот. Банки генов. Саузерн-блоттинг как метод поиска нужных генов.

генной инженерией (ГИ) – создание генетических измененных организмов в результате целенаправленного переноса в них чужеродных генов, кодирующих нужные человеку признаки и свойства. В основе ГИ лежит способность рестриктаз бактерии расщеплять ДНК. Дата рождения ГИ 1972 г. Технология переноса трасгенных – чужеродных генов и их передача в ряду поколений называется трансгенезом. Направленный перенос может осуществлятся м/у далекими филогенетическими группами. Организмы получившие в их геном чужеродные гены – трансгенные или генетически модифицированные. Процесс когда чужеродная ДНК проникает в реципиентную к-ку и вызывает у нее наследуемые изменения – трансформация. У бактерий трансформация может осуществлятся с помощью растворимых фрагментов ДНК, а у эукариот только векторы. Этапы:

- Получение нужного гена. Из естественных источников или геномной библиотеке. Синтезирован искусственно Или с помощью полимеразной цепной реакции.

- Создание вектора. Вектор – молекулы ДНК, способные переносить включенные в них чужеродные гены в к-ку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом. Свойства вектора:

• Способность к автономной репликации в к-ке. (для бактерй должен содержать сайт ori – участок инициации репликации)

• Наличие сайта в котором возможно встраивание желаемого фрагмента. Для этого должен содержать участки, чувствительные к определенной рестриктазе, которая расщепляет вектор и позволяет встроить трансген.

• наличие маркерных генов (селективные гены – устойчивость к чему то, репортерные – дают продукт удобный для тестирования).

• Для экспрессии нужно поместить под соответствующей промотор (обычно бактериальный лактозный промотор кишечной палочки)

В качестве векторов используют плазмиды – внехромосомные гененетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетке, ДНК бактериофагов, искусственные векторы – космиды.

- Трансформация.

- Молекулярная селекция – отбор клонов, несущих рекДНК. Использование маркерных генов, находящиеся в векторной молекуле.

- Выращивание измененных клеток в целые трансгенные организмы.

Саузерн блоттинг — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определенной последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами переноса разделенной по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации. Метод называется по имени изобретателя, английского биолога Эдвина Саузерна.

Метод - Рестрикция эндонуклеазами рестрикции для разрезания высокомолекулярной днк на более мелкие фрагменты.

- Фрагменты ДНК подвергаются электрофорезу в агарозном геле для разделения по длине.

- В случае, если некоторые фрагменты ДНК длиннее 15 кб, перед переносом гель обрабатывают, например, соляной кислотой, которая вызывает депуринизацию ДНК и облегчает перенос на мембрану.

- В случае, когда используют щелочной метод переноса, агарозный гель помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль ДНК денатурирует и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной для дальнейшей гибридизации. При этом разрушаются и остатки РНК.

- Листок нитроцеллюлозной (или нейлоновой) мембраны помещают сверху или снизу от агарозного геля. Давление осуществляют непосредственно на гель или через несколько слоев бумаги. Для успешного переноса необходим плотный контакт геля и мембраны. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием воды в зону с низким содержанием воды (мембрана). При этом осуществляется перенос ДНК из геля на мембрану. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий.

- Для окончательного закрепления ДНК на мембране, последняя нагревается в вакууме до температуры 80 °C в течение двух часов или освещается ультрафиолетовым излучением (в случае нейлоновых мембран).

- Осуществляют гибридизацию радиоактивно (флюоресцентно) меченной пробы с известной последовательностью ДНК с мембраной.

- После гибридизации избыток пробы отмывают с мембраны и визуализируют продукты гибридизации путем авторадиографии (в случае радиоактивной пробы) или оценивают окраску мембраны (в случае использования хромогенного окрашивания).