1.2. Культуры клеток в вирусологии и методы их получения

Культура клеток – клетки какой-либо ткани животных или человека, способные расти и размножаться в искусственных условиях.

Культуры клеток широко применяются при диагностике вирусных инфекций, в производстве вакцин, незаменимы при проведении научных исследований в области вирусологии.

Для успешного получения клеточных культур и последующего размножения в них вирусов культивируемые клетки должны постоянно находиться в сбалансированной физиологической среде, содержащей все необходимые компоненты для их жизнедеятельности и размножения.

Питательные потребности клеток обеспечиваются наличием незаменимых аминокислот (таких, как глутамат, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин, аргинин, гистидин, метионин, треонин, цистин, тирозин), витаминов (особенно комплекса В), глюкозы и сыворотки крови.

Изотоничность и буферность среды поддерживается с помощью неорганических солей. Оптимальным является рН 7,2-7,4, при длительном культивировании клеток значение рН должно оставаться в пределах 6,8-7,8. Постоянство рН в течение нескольких дней обеспечивается присутствием карбонатного и фосфатного буферов. Стабилизации значения рН способствует выращивание культур в пробирках и флаконах, закрытых резиновыми пробками, вследствие чего не улетучивается СО₂ (в противном случае это привело бы к сдвигу рН в щелочную сторону).

Контроль за реакцией среды осуществляется путём добавления индикатора фенолрот: при рН 6,8-7,2 среда имеет жёлтый цвет, при рН 7,2-7,4 – оранжево-розовый, при рН 7,4-7,6 – красный, при рН 7,7-7,8 – красно-фиолетовый.

Во время приготовления клеточных культур к солевым растворам и питательным средам нередко добавляют антибиотики, чтобы избежать бактериального и грибкового загрязнения. Применяют пенициллин и стрептомицин (по 60 000 ЕД/мл), тетрациклины, доксициклин, другие антибиотики широкого спектра действия в концентрации 0,1-0,01 мг/л; противогрибковые антибиотики – нистатин (20 ЕД/мл) и фунгизон.

Для приготовления питательной среды требуется вода высокой степени очистки, так как культура клеток очень чувствительна к ионам тяжёлых металлов. Рекомендуется применять бидистиллированную воду, перегнанную в стеклянных аппаратах или очищенную в ионообменных колонках.

Работу с культурами клеток проводят в тщательно обработанной «вирусологической» посуде из специальных сортов стекла или пластиковой посуде из полистерола для одноразового использования.

Рис. 1. Лабораторная посуда для выращивания культур клеток

Приготовленную культуру клеток инкубируют в термостате при температуре 36,0-38,5⁰С.

1.2.1. Питательные среды

Питательные среды для клеточных культур в большинстве случаев готовят на основе солевых растворов, которые имеют состав солей, качественно и количественно приближающийся к составу жидкостей животного организма.

Таблица 1

Состав основных солевых растворов (в г на л)

Вещества	Раствор Хенкса	Раствор Эрла
NaCl	8,0	6,8
KCl	0,4	0,4
CaCl2	0,14	0,2
MgSO4×7H2O	0,1	0,1
MgSO4×6H2O	0,1	-
NaH2PO4×H2O	-	0,125
NaH2PO4×2H2O	0,06	-
KH2PO4	0,06	-
Глюкоза	1,0	1,0
Фенолрот (не всегда)	0,02	0,05
NaHCO3	0,35	2,2

Различают:

1. Естественные питательные среды (применяются редко).

Естественные питательные среды готовят на основе солевых растворов Хенкса и Эрла, к которым добавляют сыворотку, амниотическую жидкость, эмбриональный экстракт. Эти биологические жидкости являются источниками белкового питания, витаминов и других веществ, способствующих росту и размножению клеток. Например, среда для культивирования клеток HeLa: сыворотка человека – 50%, куриный эмбриональный экстракт – 2%, раствор Хенкса – 48%.

2. Ферментативные гидролизаты белковых веществ.

В среды добавляют ферментативные гидролизаты: лактальбумина, казеина, белков крови крупного рогатого скота.

3. Синтетические питательные среды, которые отличаются сложным составом:

Среда 199 (Паркера) содержит 20 аминокислот,17 витаминов, пурины и пиримидины, глюкозу, 9 минеральных солей и ряд других веществ. Эту среду готовят на солевом растворе Хенкса, стерилизуют фильтрованием через бактериальные фильтры.

Среда Игла содержит 13 аминокислот, 4 катиона, 3 аниона, 6 витаминов, холин, инозит и углеводы.