МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ им. Х.М.БЕРБЕКОВА

____________________________________________________________________

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ,

ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ

Методические рекомендации по организации самостоятельного

изучения курса «Общая вирусология»

Для специальности 020201.65 – Биология

Нальчик - 2010

УДК 576.858(075.8)

ББК 52.63я73

Б-69

Рецензент:

кандидат биологических наук,

старший преподаватель кафедры микробиологии, гигиены и санитарии

Кабардино-Балкарской государственной

сельскохозяйственной академии

М.Х. Пежева

Составитель: Блиева Лариса Заурбековна

Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов: Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология». - Нальчик: Каб.-Балк. ун-т, 2010.- 48 с.

В методических рекомендациях представлены современные методы исследования вирусов. Описываются особенности работы с вирусами, методы их культивирования, индикации и идентификации.

Издание рассчитано на самостоятельную работу при подготовке к лабораторным занятиям студентов, обучающихся на 3 курсе по специальности «Биология».

Рекомендовано РИС университета

УДК 576.858(075.8)

ББК 52.63я73

Б-69

Кабардино-Балкарский

государственный университет, 2010

ВВЕДЕНИЕ

В методических рекомендациях по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» предлагаются методики самостоятельного изучения студентами основ культивирования, индикации и идентификации вирусов.

Согласно учебному плану по специальности 020201.65 студентам 3 курса Биологического факультета в течение одного семестра преподаётся дисциплина «Микробиология, вирусология».

Вирусология – медико-биологическая наука, изучающая вирусы: их строение, биохимию, систематику, генетику, а также значение в жизни человека.

В результате изучения вирусологии студенты должны знать особенности вирусов, овладеть практическими навыками и умениями в заборе материала для вирусологических исследований, проведении лабораторных методов диагностики заболеваний и в оценке их результатов. При изучении вирусологии используются знания, полученные студентами при прохождении общей биологии, гистологии, биохимии, генетики, физиологии.

Общий объём дисциплины «Микробиология, вирусология» составляет 210 часов, из которых 68 часов аудиторных и 142 часа на самостоятельную работу. Согласно учебно-тематическому плану на освоение вирусологии отводится 38 часов, из которых 10 часов аудиторных и 28 часов на самостоятельную работу.

Существующие учебники и практические руководства не отражают всех вопросов, затрагиваемых в этом курсе. Настоящие методические рекомендации разработаны по темам соответствующим лабораторным занятиям и содержат методы не представленные в лабораторном практикуме.

Основное внимание уделено современным методам применяемым в вирусологии, вместе с тем студенты знакомятся с фундаментальными принципами и нюансами вирусологических методов исследования.

В данное издание включены разделы: 1 – культивирование вирусов; 2 – индикация и идентификация вирусов. Собраны: описание подготовки материала для вирусологических исследований, методы обработки вируссодержащего материала, выделение и культивирование вирусов различными способами, методы индикации и идентификации вирусов и молекулярно-генетические методы исследования в диагностике вирусных инфекций. К каждому разделу даётся перечень контрольных вопросов, тематика докладов о результатах самостоятельной работы и список рекомендуемой литературы.

Раздел 1. Культивирование вирусов

1.1. Подготовка материала для вирусологических исследований

1.1.1. Правила работы в вирусологической лаборатории

В вирусологической лаборатории проводят работу по выделению штаммов вирусов, их идентификации и культивированию, выполняются различные научные исследования. При работе с вирусами необходимо прежде всего:

1. Не допустить загрязнения штаммов вирусов посторонней микрофлорой;

2. Обеспечить безопасность работающего персонала от возможного заражения вирусами;

3. Обеспечить безопасность окружающего населения от заражения вирусными инфекциями через сточные воды, трупы экспериментальных животных и т.п.

Методы исследования, применяемые в вирусологии отличаются значительной сложностью, что связано прежде всего с абсолютным внутриклеточным паразитизмом вирусов и их малыми размерами.

При исследовании материалов, полученных от больных вирусными инфекциями, с целью лабораторной диагностики этих заболеваний применяются различные методы:

• Методы электронной и в меньшей степени световой микроскопии;

• Методы выделения и культивирования вирусов в культурах клеток;

• Методы выделения и культивирования вирусов в развивающихся куриных эмбрионах и в организме чувствительных экспериментальных животных;

• Выявление вирусов по их гемагглютинирующей способности;

• Различные серологические методы исследования: традиционные и экспресс-методы;

• Молекулярно-генетические методы исследования – молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция.

1.1.2. Материалы, исследуемые при вирусных инфекциях

При взятии инфекционного материала от людей и животных необходимо учитывать тропизм вирусов к определённым тканям и органам, пути выделения вируса во внешнюю среду и особенности патогенеза той или иной вирусной инфекции.

Различают пневмотропные, энтеротропные, гепатотропные, лимфотропные, нейротропные и дермотропные вирусы. В зависимости от тропизма исследованию подвергают различные материалы. Например, исследуют слизь из зева, мокроту и т.п., если виру пневмотропный; испражнения – при энтеротропных вирусах; жидкость из визикул или пустул, корочки – если вирус обладает дермотропностью и т.д.

1.1.3. Обработка вируссодержащего материала

Инфекционные материалы, взятые с учётом тропизма вирусов и с соблюдением асептики, помещают в стерильную посуду, тщательно закупоривают её и направляют в лабораторию, поместив в термос со льдом.

Материал рекомендуется исследовать в кратчайший срок, так как вирусы быстро инактивируются. Сохранению вируса способствует помещение исследуемого материала (в 50%-ном растворе глицерина) в холодильник при температуре не выше 5^оС. Но самый надёжный способ – это хранение в замороженном состоянии при температуре -45^оС и ниже; в таких условиях вирус может оставаться жизнеспособным длительное время.

Обработка плотного материала, содержащего вирусы, начинается с растирания его в ступке или измельчения в специальных аппаратах – гомогенизаторах. Затем готовится 10%-ная взвесь в солевом растворе, которую центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 15-30 минут для осаждения крупных частиц. Вирусы остаются в надосадочной жидкости, которую и подвергают дальнейшему исследованию.

Жидкий вируссодержащий материал непосредственно центрифугируют и также получают надосадочную жидкость.

Если есть сомнения в бактериологической стерильности исследуемой вируссодержащей надосадочной жидкости, к ней добавляют антибиотики, чтобы уничтожить посторонние микроорганизмы. Антибиотики не влияют на вирусы, и они сохраняют свою жизнеспособность.