2.2. Типы антисмысловых рнк

Бактериальные асРНК не имеют одного общего характерного свойства, кроме их считывания с цепи ДНК, противоположной матричной цепи какого-то гена. Тем не менее, они могут быть классифицированы в зависимости от их расположения: 1) как 5'-перекрывающиеся (расходящиеся), 2) 3'-перекрывающиеся (сходящиеся) и 3) находящиеся внутри друг друга. Транскрипты белок-кодирующих генов с длинными 5'- или 3'-нетранслируемыми участками (UTR), существенно перекрывающимися с мРНК других генов, представляют эффективный способ образования регуляторных связей между генами (Georg et al., 2009). У цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120 ген alr1690 имеет необычно большой 3'-UTR, который целиком перекрывает ген-регулятор поглощения железа furA. При этом у мутанта Δalr1690 наблюдали повышенный синтез белка FurA и фенотип, характерный для клеток, испытывающих недостаток железа (Hernández et al., 2006; 2010). Некоторые асРНК могут содержать открытую рамку считывания в неперекрывающейся с другим транскриптом части, как это показано для as_slr0882 Synechocystis 6803 (Georg et al., 2009) и гена iiv14 (cosA) Pseudomonas fluorescens PF0-1 (Silby et al., 2008). Ген cosA перекрывает рамку считывания Pfl_0939 на 987 из 1020 н., и его неперекрывающаяся часть кодирует белок эффективной колонизации почвы. Наконец, есть короткие асРНК, которые перекрывают только 5'-UTR гена-мишени и имеют некоторые признаки транс-действующих нкРНК: например SyR7 у Synechocystis 6803 (Georg et al., 2009) и SymR у E.coli (Kawano et al., 2007).

Размеры асРНК колеблются в широких пределах. Существуют сравнительно короткие асРНК, от 100 до 300 н., как SymR (Kawano et al., 2007) и SyR7 (Georg et al., 2009), хотя в основном они существенно длиннее, от 700 до 3500 нуклеотидов (Georg et al., 2009; Lee et al., 2010; Stazic et al., 2011). Известен пример огромной асРНК: транскрипт длиной до 7000 н. перекрывает оперон из 14 генов рибосомных белков у Prochlorococcus sp. MED4 (Stazic et al., 2011). Уровни экспрессии асРНК варьируют от едва уловимых до значительных. У Synechocystis 803 обнаружены асРНК, накапливающиеся до уровня мРНК конститутивно сильно экспресирующегося гена, например, такого как amt1, кодирующего белок-транспортер аммония (Georg et al., 2009).

2.3. Механизмы действия асРнк у бактерий

В то время как знание о числе асРНК у отдельных бактерий быстро увеличивается, информация о молекулярных механизмах их действия накапливается значительно медленнее. Между тем хорошо изучены функциональные характеристики нескольких асРНК бактериофагов и плазмид и многих транс-действующих нкРНК (Brantl, 2007).

2.3.1. Изменение стабильности целевой РНК

Взаимодействие асРНК с РНК-мишенью приводит к изменению вторичной структуры обеих взаимодействующих молекул и образованию формы дуплексной РНК. Эти структурные изменения по-разному влияют на стабильность и период полураспада РНК. В некоторых случаях следствием образования дуплекса является быстрая и полная деградация обеих РНК. Ярким примером служит асРНК OOP длиной 77 н. фага λ, которая комплементарна 3'-концу мРНК белка CII, активатора функции репрессора CI. Сверхэкспрессия OOP приводит к расщеплению мРНК CII РНКазой III, первоначально на двух участках: один в 3'-конце кодирующей области и один в области между генами CII и О (Krinke, Wulff, 1990; Krinke et al., 1991).

Взаимоисключение РНК IsiA/IsrR у Synechocystis 6803. Хорошо изученным примером кодеградации является пара смысловой/антисмысловой РНК IsiA/IsrR Synechocystis 6803 (Dühring et al., 2006). Белок IsiA участвует в стрессовом ответе и приводит к существенной реорганизации фотосинтетического аппарата, формированию кольцевой структуры вокруг фотосистемы I (Dühring et al., 2006). Таким образом, синтез IsiA должен быть подвержен строгой регуляции, которая отчасти достигается за счет IsrR (рис. 1). Транскрипты двух генов накапливаются в обратной зависимости друг от друга, и, следовательно, обе РНК существуют практически в виде взаимоисключающих друг друга структур. АсРНК IsrR транскрибируется с конститутивного промотора, в то время как транскрипция isiA индуцируется недостатком железа, окислительным или световым стрессом. Когда присутствуют обе РНК одновременно, они образуют РНК-дуплексы, которые немедленно расщепляются по неизвестному механизму. Таким образом, генетическая информация isiA не может быть реализована, пока молекулы мРНК IsiA не оттитруют все молекулы асРНК. Избыточная концентрация и асРНК IsrR, и комплементарного ей участка мРНК IsiA, реципрокно приводит к разрушению соответствующего антагониста. Интересно, что сами по себе эти одноцепочечные молекулы РНК являются очень стабильными; период полураспада IsrR более 45 мин (Legewie et al., 2008). В результате IsrR вызывает не только задержку экспрессии гена isiA в ранней фазе стресса, но и быстрое истощение мРНК IsiA в период восстановления после стресса, когда транскрипция isiA прекращается. Такая регуляция известна как механизм "порогового линейного отклика" (Legewie et al., 2008).

Рис. 1. Физическая карта промоторов и генов мРНК IsiA и асРНК IsrR (А), а также схема взаимоисключения этих РНК в норме и при стрессе у Synechocystis 6803 (Б). Линия-пунктир – потенциальная кривая синтеза-распада мРНК IsiA в отсутствие IsrR. Заимствовано из работ Dühring et al., 2006 (А) и Legewie et al., 2008 (Б).

Процессинг и стабилизация мРНК с участием асРНК GadY E. coli. Взаимодействие мРНК и асРНК не обязательно приводит к их деградации. РНК-дуплекс также может генерировать специфический сайт процессинга, что приводит к поступательной инактивации мРНК, либо формированию зрелой или стабилизированной мРНК. АсРНК GadY у E. coli участвует в ответе на кислотный стресс. Ген асРНК GadY расположен в 3'-конце гена gadX, который является активатором глутамат-зависимой системы устойчивости к кислотам (Opdyke et al., 2004). GadY контролирует уровень мРНК GadX, вызывая расщепление бицистронной мРНК GadXW. Разделенные мРНК GadX и GadW обладают повышенной стабильностью (Opdyke et al., 2011). Было показано, что в процессинг мРНК GadXW могут быть вовлечены РНКаза E (Takada et al., 2007) и РНКаза III (Opdyke et al., 2011). Не исключено, что данный пример иллюстрирует весьма распространенный механизм позитивной регуляции генов с участием асРНК.

Взаимодействие между бактериальными асРНК и РНКазой Е. Описан пример защиты мРНК, с 5’-участком которой взаимодействует асРНК, от расщепления РНКазой Е in vitro (Mackie, 1998). В клетках цианобактерии Prochlorococcus MED4, инфицированных фагом P-SSP7, большинство хозяйских мРНК обладает меньшим периодом полураспада, чем в неинфицированных клетках. Вероятно, такое состояние поддерживается усилением активности хозяйской РНКазы Е, о чем свидетельствует повышенный уровень ее мРНК (Lindell et al., 2007). Интересно, что некоторые из мРНК, содержание которых было повышено в инфицированных клетках, имеют большие асРНК (до 7 т.н.), которые также были индуцированы. Взаимодействие длинных асРНК с полицистронными мРНК маскировало сайты расщепления РНКазой Е и предотвращало деградацию (Stazic et al., 2011). Вместе с тем существует пример деградации мРНК РНКазой Е при участии асРНК в системе AmgR/mgtC у Salmonella enterica (Lee, Groisman, 2010).

2.3.2. Нарушение трансляции мРНК

В некоторых случаях деградация РНК имеет второстепенное значение для подавления экспрессии генов. Примером может служить регуляция ответа, связанного с SOS-белком SymE у энтеробактерий. Он считается токсин-подобной РНК-эндонуклеазой и строго контролируется в обычных условиях. Один из механизмов подавления активности SymE связан с асРНК SymR (Kawano et al., 2007). SymR перекрывает 5 'конец мРНК SymE, в том числе сайт связывания рибосомы и стартовый кодон AUG. Таким образом, формирование РНК-дуплекса SymE/SymR несовместимо со связыванием 30S субъединицы рибосомы и предотвращает инициацию трансляции гена symE. Пока не ясно, непосредственно связывание асРНК вызывает повышенную деградацию мРНК SymE, или это вторичный эффект блока посадки рибосомы на мРНК. Показано, что распад РНК происходит без участия РНКазы III (Kawano et al., 2007). Такой же тип негативной регуляции трансляции возможен для многих асРНК, которые перекрывают сайт связывания рибосомы или стартовый кодон мРНК.

Регуляция трансляции не обязательно затрагивает сайт посадки рибосом. Недавние исследования транс-действующих нкРНК показали, что область, достаточная для ингибирования трансляции не обязательно включает сайт связывания рибосом. Например, связывание регуляторной РНК с пятым кодоном также ингибирует посадку рибосомы (Bouvier et al., 2008). И наоборот, связывание с участком, находящимся выше от сайта посадки рибосомы, может репрессировать (istR) (Darfeuille et al., 2007) или не индуцировать трансляцию (dsrA) (Majdalani et al., 1998).

2.3.3. Терминация транскрипции мРНК

В дополнение к пост-транскрипционным механизмам существуют механизмы, которые непосредственно влияют на транскрипцию генов-мишеней. Система транспорта железа у Vibrio anguillarum кодируется опероном, который включает в себя гены четырех сидерофоров, транспортирующих трехвалентное железо (fatDCBA), два гена биосинтеза сидерофоров (angR and angT), а также две асРНК (RNAα и RNAβ) (Chen, Crosa, 1996; Salinas, Waldbeser, Crosa, 1993; Waldbeser , Chen, Crosa , 1995; Waldbeser et al., 1993). В то время как RNAα подавляет экспрессию fatA и fatB при высокой концентрации железа, RNAβ вызывает дифференциальную транскрипцию всего оперона fatDCBA-angRT и укорочение мРНК FatDCBA (Stork et al., 2007). RNAβ комплементарна 3′-участку fatA и 5'-концу angR. Связывание асРНК с растущей полицистронной мРНК FatDCBA приводит к терминации транскрипции на потенциальной шпильке близ стоп-кодона fatA. То же происходит при добавлении RNAβ in vitro, что исключает другие механизмы регуляции, такие как кодеградацию или транскрипционную интерференцию (Stork et al., 2007).

Другим примером служит ген вирулентности icsA (virG) Shigella flexneri, который контролируется асРНК RnaG. RnaG репрессирует транскрипцию, используя механизм транскрипционной интерференции и затухания транскрипции (Giangrossi et al., 2010). 5’-конец мРНК IcsA образует две длинные шпильки, которые напоминают структуру антитерминатора. Связывание асРНК с активно транскрибирующейся мРНК препятствует образованию антитерминатора и способствует образованию шпильки, которая терминирует транскрипцию. Кроме того, мутации, нарушающие спаривание оснований в терминаторе, значительно снижают ингибирование транскрипции, вызванное асРНК (Giangrossi et al., 2010).

2.3.4. Активация трансляции

У Synechocystis 6803 идентифицирована комплементарная пара: мРНК РsbA2 – асРНК РsbA2R (Sakurai, 2012). Ген psbA2 кодирует белок D1 фотосистемы II. У мутантов по РsbA2R рост сильно замедлен в условиях яркого освещения, и наблюдается пониженное содержание белка D1. Оказалось, что мРНК РsbA2 имеет 2 сайта РНКазы Е: сайт AU и сайт вблизи участка посадки рибосомы. Образование дуплекса с асРНК защищает мРНК от разрезания. Предполагают, что AU-сайт на 5’конце мРНК защищается асРНК, а второй сайт РНКазы Е – рибосомой (рис. 2). Таким образом, асРНК могут участвовать в активации генов на уровне трансляции.

Рис. 2. Механизм позитивной регуляции экспрессии гена psbA2 на уровне трансляции с участием асРНК РsbA2R у Synechocystis 6803 (из работы Sakurai, 2012).

2.3.5. Транскрипционная интерференция

В механизме транскрипционной интерференции друг на друга влияют промоторы, с которых идут встречные или конвергентные потоки транскрипции. Современное открытие огромного количества асРНК и других нкРНК в клетках бактерий показало, что близко расположенных промоторов значительно больше, чем ранее считалось. А это значительно увеличивает потенциал транскрипционной интерференции (Jens, Wolfgang, 2011). Существует три основных механизма, которые способствуют интерференции в различной степени (Shearwin et al., 2005; Sneppen et al., 2005).