2.2 Антисмысловые рнк и их роль в регуляции генов у бактерий

До недавнего времени транскриптомы бактерий представляли весьма упрощенно, поскольку их геномы практически целиком состоят из генов, кодирующих белки, и генов рибосомных и транспортных РНК. Однако полногеномные исследования с использованием новейших технологий обнаружили масштабную транскрипцию различных генных и межгенных участков, а также участков ДНК, комплементарных кодирующим последовательностям (антисмысловая транскрипция; природные антисмысловые РНК, асРНК) (Rasmussen et al., 2009; Dornenburg et al., 2010; Mitschke et al., 2011). Оказалось, что в целом некодирующие РНК (нкРНК) могут преобладать в транскриптомах бактерий; например, у Synechocystis 6803 они составляют около 65% всех выявленных транскриптов (Mitschke et al., 2011). Такую сложную организацию транскриптома принято считать типичной для эукариотических организмов, у которых лишь небольшая часть генома кодирует белки, и до 90% транскриптов представлено нкРНК с известными или предполагаемыми регуляторными функциями (Beiter et al., 2009). При этом в частности, основные генетические различия между человеком и высшими приматами объясняют в настоящее время не структурным различиями в геномах, а структурно-функциональными особенностями нкРНК. Вместе с тем значительная доля асРНК (от числа всех генов) выявлена в транскриптомах филогенетически далеких объектов: 72% у мышей (Katayama et al., 2009), 16,8% у плодовой мушки Drosophila melanogaster (Zhang et al., 2006), 27% у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (David et al., 2006) и 7,4% у растения Arabidopsis thaliana (Henz et al., 2007).

Природные асРНК были впервые обнаружены более 30 лет назад у бактерий (Itoh, Tomizawa, 1980; Lacatena, Cesareni, 1981), а для бактериофага λ постулированы еще раньше (Spiegelman et al, 1972). О первом случае антисмысловой регуляции экспрессии генов у архей стало известно в 1993 году, когда у фага H экстремально галофильной археи Halobacterium salinarium выявили асРНК, комплементарную первым 151 нуклеотидам транскрипта T1 (Stolt, Zillig, 1993). Сначала несколько изученных хромосомных, плазмидных и фаговых асРНК прокариот считали скорее исключением, чем правилом. Однако эти примеры показали, что природные асРНК присутствуют во всех трех царствах живого, хотя последние годы их исследовали в основном у эукариот. Новые данные позволяют полагать, что регуляция экспрессии генов с помощью асРНК представляет собой особый уровень управления геномом.

2.1. Антисмысловые рнк бактерий

Антисмысловая транскрипция бактерий долго оставалась в тени в основном из-за трех технических проблем. Две из них: отсутствие надежных биоинформатических алгоритмов, способных выделить асРНК из транскриптома, и то, что обнаружение антисмысловой транскрипции при анализе микрочипов признавали артефактом, полученным в процессе синтеза кДНК (Perocchi et al., 2007). Третьей проблемой была интерпретация экспериментальных данных. Самое раннее систематическое исследование Escherichia coli показало, что от 3000 до 4000 открытых рамок считывания (ОРФ) могут иметь антисмысловые РНК, если учитывать низкий уровень транскрипции, проходящей практически по всему геному (Selinger et al., 2000). При этом основная проблема заключалась в неспособности отличить синтез асРНК с регуляторными функциями от транскрипционного шума. Затем было показано, что можно преодолеть все три указанных препятствия (Georg et al., 2009). Для этого предлагалось прямо маркировать РНК, а не кДНК, для гибридизации с микрочипами, чтобы избежать непреднамеренного синтеза второй цепи ДНК, а также проводить строгое сравнение результатов и вычислительных предсказаний с нацеливанием на высокий уровень экспрессии асРНК. В настоящее время экспериментально подтвержденное количество асРНК у цианобактерии Synechocystis 6803 возросло до 73 (Dühring et al., 2006); причем полагают, что около 10% всех генов, кодирующих белки, связаны с асРНК (Georg et al., 2009). Таким образом, подходы к изучению антисмысловых транскриптов у бактерий существенно развивались благодаря разработке эффективных методов, таких как секвенирование, микрочипы и прямое мечение РНК.

Недавний анализ транскриптома, основанный на технологии секвенирования компании Illumina, подтвердил масштабную антисмысловую транскрипцию и выявили около 1000 различных асРНК у E. coli (Dornenburg et al., 2010). Установлено, что транскрипция 25 асРНК E. coli является Rho-зависимой (Peters et al., 2009). Возможно, остановки РНК-полимеразы при Rho-зависимой терминации являются важным элементом механизма транскрипционной интерференции (Palmer et al., 2009). Исследования с использованием микрочипов показали, что у Synechocystis 6803 асРНК составляют около 26,8% общего количества транскриптов (Mitschke et al., 2011), тогда как у Helicobacter pylori с очень компактным геномом – 46% всех аннотированных ОРС (Sharma et al., 2010). Работа Sharma et al., 2010 стала первой, в которой был проведен полный анализ бактериального транскриптома и было показано, что антисмысловая транскрипции является активным, запланированным процессом, результатом инициации транскрипции, а не случайным считыванием РНК через терминаторы.