2. Обзор литературы

2.1 Гомеостаз металлов у прокариот

Микроэлементы, в частности металлы, являются необходимыми элементами для функционирования части белков. Наиболее распространенные Mg^{2 +}, Zn^{2 +}, Mn^{2 +}, Cu ^2+/+ и Fe ^{2+ / 3 +}. В меньшей степени другие переходные металлы, такие как Со^{2 +}, Ni^{2 +} или Mo^{2 +} также являются важными факторами, способствующие выполнению различных функций белков. В то время как потребности и количество металлов варьирует между видами, их внутриклеточная концентрация в любом случае должна быть под жестким контролем, чтобы поддерживать жизнеспособность клеток. Наряду с цинком и магнием железо требуется для роста почти всем микроорганизмам, за исключением некоторых молочнокислых бактерий и рода Borrelia (Posey, Gherardini, 2000), оно присутствует в гем-содержащих белках, железо-серных белках и др. Железосодержащие белки работают не только как переносчики электронов, но и участвуют в ферментативном катализе, выступают в качестве датчиков для контроля внешних и внутренних условий, регулируя экспрессию многих генов (Lill, 2009). Кроме того, железо занимает центральное место в определении взаимодействий патоген-хозяин в организме растений и животных, влияя на результат инфекционных заболеваний в пользу одной из сторон (Nairz et al., 2010). Несмотря на важную роль в метаболизме бактерий, многие микроэлементы труднодоступны в природе. Так дефицит железа является ограничивающим фактором, определяющим первичную продуктивность океана (Coale et al., 1996). Для выживания в условиях дефицита клетки развитии ряд ответов, таких как уменьшение размеров, сокращение числа вторичных метаболитов, синтез альтернативных белков, разнообразные пути эффективного поглощения железа из среды. Такие стратегии позволяют поддерживать гомеостаз металлов и точно регулировать экспрессию генов для физиологической адаптации к изменяющимся условиям и для предотвращения перегрузок различных цепей, интермедиаты которых могут быть токсичными для клеток. В частности, железо катализирует образование активных форм кислорода в клетке, участвуя в преобразовании пероксид водорода в гидроксильный радикал (реакция Хабера-Вайса). Существует много доказательств корреляции окислительного стресса с изменением пула свободного внутриклеточного железа в естественных условиях, а также генетические исследования, показывающие, что нарушение регуляции гомеостаза железа приводит к окислительному стрессу (Touati, 2000; Latifi et al., 2005; Cornelis et al., 2011). Контроль метаболизма железа и его связь с регуляцией окислительного стресса в прокариотических организмах осуществляет ген fur (ferric uptake protein). Такое же название имеет суперсемейство генов, кодирующих транскрипционные факторы, осуществляющие контроль гомеостаза различных металлов и согласование ответа на окислительный стресс (Таблица 1).

Табл. 1. Белки, принадлежащие суперсемейству FUR

Основной ответ	Белок	Регуляторный металл	Структурный метал
Гомеостаз металлов	Fur	Fe2+	Zn2+
	Zur	Zn2+	Zn2+
	Nur	Ni2+	Zn2+
	Mur	Mn2+	-
Окислительный стресс	PerR	Fe2+	Zn2+
Доступность гемма	Irr	Fe2+ (гемм)	-

Общие черты транскрипционных факторов суперсемейства FUR (ferric uptake protein)

Белки семейства FUR встречаются у прокариот повсеместно. В настоящее время известно известны 10000 последовательностей, принадлежащих 4091 видам различных бактерий и архей (Fillat, 2014). Упрощенная модель наиболее распространенного механизма действия Fur заключается в специфическом связывании димера белка и металла-кофактора в качестве корепрессора с палиндромными А/Т богатыми последовательностями, находящимися в промоторе контролируемых генов (Bagg, Neilands, 1987). Связывание кофактора вызывает конформационные изменения белка-регулятора, что способствует стабильному взаимодействию с ДНК. Хотя между белками суперсемейства существуют важные структурные различия, они имеют общую длину, кратную 120 аминокислотам. На N-конце они содержат ДНК-связывающий домен, а на С-конце регуляторный металл-связывающий участок, способный к димеризации (рис.1). Как правило, белки этого суперсемейства содержат гистидин-богатую область HHHXHX₂CX₂C, расположенную в начале димеризационного домена после шарнирной области между ДНК-связывающим доменом и С-концом (http://pfam.xfam.org/family/PF01475). В большинстве случаев первым аминокислотным остатком является аспаргин. Менее консервативный мотив CXXC находится на С-конце некоторых паралогов белка Fur, у всех Zur и PerR, найденных на сегодняшний день.

Белки этого семейства обычно регулируют свою собственную экспрессию, однако были зарегистрированы многие другие факторы, влияющие на окончательный уровень концентрации активного регулятора в клетке. Как правило, в клетке активны несколько белков данного семейства с различными функциями (Hantke, 2001; Botello-Morte et al., 2013; Fuangthong, Helmann, 2003), из-за чего часто возникают функционально значимые пересечения и перекрывания регуляторных областей (Fuangthong et al., 2002; Hernandez et al.,2004; Hohle, O’Brian, 2010; Horsburgh et al., 2001).

Металл-связывающие свойства белков FUR

Биохимические и структурные исследования показали различия в путях, используемых различными белками семейства для восприятия экологических стимулов и обработки информации для модуляции соответствующих целей. В дополнение к ожидаемому железа-связывающему сайту, в кристаллизованном белке Fur из Escherichia coli и Vibrio anguillarum был найден структурный атом цинка по одному на мономер (Althaus et al., 1999; Zheleznova et al., 2000), видимо необходимый для стабилизации димерной формы белка (D’Autreaux et al., 2007) (рис.1).

Рис.1. Третичная структура димера Fur H. pylori (Pohl et al., 2003) с указанием трех ионов металлов. Структурный Zn²⁺ (участок 1) показан красным шариком. Ион Zn²⁺, связанный с регуляторным сайтом (участок 2), окрашен в темно-синий. Третий ион, находящийся в третьем участке, окрашен в пурпурный.

(А) Димер Fur, связанный с ДНК (не показана). ДНК-связывающий домен А-цепи окрашен в пурпурный цвет, промежуточный домен (способный изгибаться) в оранжевый, димеризцющий домен в голубой. В-цепь показана зеленой.

(Б) Другая ориентация димера Fur. А-цепь окрашена с серый, В-цепь в зеленый.

(В) Выравнивание последовательностей гистидин-богатых участков паралогов Fur различных организмов. Желтым отмечена область первичной последовательности, вовлеченная в процесс димеризации.

Существуют важные различия между структурой белков Fur различных видов. Показано, что Fur Helicobacter рylori имеет 3 металл-связывающих сайта (рис.1), уникальный структурированный N-конец и необычные спирали на С-конце, что связывают с его активностью в апо-форме (Butcher et al., 2012). С другой стороны у Pseudomonas aeruginosa и Vibrio cholerae Fur содержит по 2 атома цинка на мономер (Pohl et al., 2003; Sheikh et al., 2009). Кроме того, некоторые эксперименты говорят о незначительной роли ионов цинка у Pseudomonas aeruginosa (Sheikh et al., 2009; Lewin et al., 2002). У Anabaena sp. PCC 7120 белок Fur не содержит иона цинка, хотя удалось обнаружить 2 сайта связывания для него (Hernandez et al., 2002). Есть предположения, что ионы металла не играют важной структурной роли (Fillat, 2014). Другая интересная особенность Fur заключается в его степени олигомеризации (в основном в виде тримеров) в зависимости от окислительно-восстановительного состояния среды, межмолекулярные взаимодействия в основном происходят за счет дисульфидных связей и гидрофобных взаимодействий (Lostao et al., 2010).

ДНК-связывающий сайт

Футпринтинг анализ показал наличие 19-нуклеотидной последовательности GATAATGATAATCATTATC, названной Fur-box, используемой ассоциированным с железом белком Fur для взаимодействия с промотором (de Lorenzo et al., 1988). Кроме того существуют мнения, что в качестве Fur-box могут выступать 3 повтора GATAAT (Escolar et al., 1998), а в B. Subtilis бокс имеет конфигурацию 15 пар оснований (7-1-7) (Baichoo, Helmann, 2002). Исследования целевых генов, регулируемых Fur, показали, что схожести последовательности в промоторе с консенсусной на 50-80% достаточно для связывания регулятора (Baichoo et al., 2002; Sebastian et al., 2002; Thompson et al., 2002). Во всех случаях эти боксы имеют А/Т богатый регион.

В некоторых случаях помимо последовательности Fur-box для оптимального связывания требуется наличие дополнительных последовательностей. Была исследована способность белка Fur Anabaena sp. PCC 7120 связываться с синтетической последовательностью из 27 нуклеотидов, содержащей Fur-box. Оказалось, что связывается регулятор с такой последовательностью с малой эффективностью (Gonzalez et al., 2011). Стоит отметить случай с Fur из Bradyrhizobium japonicum, который связывается с промотором гена irr, в котором Fur-box не обнаружено (Friedman, O’Brian, 2003). Кроме этого стоит отметить незначительные отличия между боксами для разных белков семейства FUR (Fuangthong, Helmann, 2003).

Fur: больше чем регулятор

Fur является основным членом семейства FUR, имеющим огромное число паралогов. Несмотря на обширные исследования функций Fur полная картина до сих пор неясна. Выявление все большего количества генов, входящих в Fur-регулон у разных видов свидетельствует о его роли в качестве глобального регулятора. Тем не менее многие гены, предполагаемо регулируемые Fur кодируют неизвестные гипотетические белки с неизвестными функциями. Опираясь на способность Fur взаимодействовать с гемом и другими сигнальными молекулами, а именно NO и CO предположили, что в дополнение к регуляторной функции Fur может выполнять и другие (Igarashi et al., 2011; Pellicer, et al., 2012). Кроме того есть предположения, что Fur может работать как датчик окислительно-восстановительного статуса клетки (Botello-Morte et al., 2014). Так как потенциально in vivo Fur взаимодействует с другими белками, реагирующими на окислительный стресс, может быть выдвинута гипотеза об участии Fur в электронно-транспортной передаче у цианобактерий (Fillat, 2014). Все эти данные говорят о том, что Fur может выполнять ряд других важных функций, не связанных с регуляцией.

Fur участвует в детекции разнообразных внешних факторов и в патогенезе

Fur контролирует метаболизм железа у большинства прокариот за несколькими исключениями: грамм-положительные Mycobacterium spp.и археобактерии, у которых гомеостаз железа находится под контролем генов семейства DtxR (Hantke, 2001; Andrews et al., 2003; Gold et al., 2001; Louvel et al., 2009; Zhu et al., 2013). Как бактерии, некоторые грибы и растения, грамм-отрицательные бактерии на примере E.coli использует внеклеточные хелаторы железа, называемые сидерофорами, для эффективного транспорта растворенного железа в цитоплазму (Zhu et al., 2013). Все гены, участвующие в синтезе сидерофоров и их специфических рецепторов (Cir, FecA, FepA,FhuA, FhuE и Fiu) находятся под контролем Fur (Earhart, 1996). Точно так же Fur регулирует экспрессию АВС-транспортеров (FecBCDE, FepBCDEFG и FhuBCD) и белков, участвующих в запасании железа (Bfr, FtnA и FtnB). Fur также играет роль в патогенезе, контролируя экспрессию факторов вирулентности в взаимодействии патоген-хозяин, а также в регулировании производства токсина свободноживущих бактерий, таких как Vibrio spp., P.aeruginosa, Legionella pneumophila и цианобактрии Microcystis aeruginosa (Allard et al., 2006; Kim et al., 2013; Mey et al., 2005; Ochsner et al., 1995; Sevilla et al., 2008). В последние годы интенсивная научно-исследовательская работа велась в направлении понимания действия Fur на развитие вирулентности (Carpenter et al., 2009; Troxell et al., 2013). Для патогенеза и колонизации клеток хозяина H. Pylori требуется нормальное функционирование гена fur, что показали на таких моделях как песчанка и мышь (Bury-Mone et al., 2004; Gancz et al., 2006). Аналогично, отсутствие или недостаточная экспрессия Fur является причиной ослабленной вирулентности Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes и V. cholerae (Horsburgh et al., 2001; Mey et al., 2005; Rea et al., 2004; Torres, e al., 2010). У Campylobacter jejuni дефект Fur привел к невозможности колонизировать ЖКТ цыплят (Palyada et al., 2004).

Анализ на микрочипах в сочетании с футпринтингом N. meningitidis и N. gonorrhoeae позволили выявить Fur-регулируемые гены, участвующие в контроле патогенеза (Yu, Genco, 2012). Fur отвечает за нивелирование окислительных агентов, направляемых от хозяина патогену, за устойчивость к кислотам (Salmonella typhimurium) (Gancz et al., 2006; Hal et al., 1996), контроль усвоения рибофлавина в C. jejuni (Crossley et al, 2007) и устойчивость к осмотическому стрессу у Desulfovibrio vulgaris (Bender et al., 2007). Кроме того, у Pseudomonas spp. Fur связан с формированием биопленок (Banin et al., 2005) и регуляцией чувства кворума, опосредованную через некодирующие РНК PrrF1 и PrrF2 (Oglesby et al., 2008). У P. рseudoalcaligenes Fur участвует в контроле дыхания и обусловливает резистентность к действию цианидов (Becerra et al., 2011). Было высказано предположение, что у Shewanella piezotolerans Fur является датчиком бескислородных условий, косвенно регулируя анаэробное дыхание через ArcА (Yang, et al., 2013). В азотфиксирующего цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120 Fur является главным регулятором гомеостаза железа и непосредственно контролирует множество генов, вовлеченных в фотосинтез, дыхание и ответ цианобактерий на окислительно-восстановительный стресс (Gonzalez et al., 2011; Gonzalez et al., 2010; Gonzalez et al., 2012). Правильная экспрессия Fur требуется для полной дифференциации функционирующих гетероцист (Gonzalez et al., 2013). Интересно, что все гены, вовлеченные в метаболизме азота координируются Fur и NtcA, главным регулятором метаболизма азота у цианобактерий (Lopez-Gomollon, Pellicer et al., 2007). Следует отметить, что в гетероцистах Fur экспрессируется на очень высоком уровне (Lopez-Gomollon, J.A. Hernandez et al., 2007). Связано ли это с бескислородной средой еще предстоит выяснить.

Все эти данные свидетельствуют о центральной роли Fur в метаболизме прокариот через модуляцию множества генов, вовлеченных в ответ на различные раздражители (рис. 2).

Рис. 2. Обзор клеточных процессов, регулируемых Fur (Fillat et al., 2014)

Механизмы репрессии и активации, осуществляемые Fur

Предполагается, что в основном Fur работает как репрессор транскрипции, связываясь с Fe²⁺ и соответствующими цис-регуляторными элементами, располагающимися выше генов-мишеней (Bagg, Neilands, 1987). Тем не менее, все больше факторов указывает на то, что на самом деле Fur модулирует транскрипцию генов, позволяющих либо репрессировать, либо активировать с помощью различных механизмов другой ген. Впервые такую теорию высказали после открытия того факта, что в H. pylori инактивация гена fur привела к инактивации железо-запасающего белка Prf (Delany et al., 2001). Также отметим регуляцию гена sodB белком Fur в отсутствие кофактора (железа) (Ernst et al., 2005). В отличие от E. coli, где регуляция sodB опосредована небольшой РНК RhyB (Masse et al., 2002), соответствующий ортолог у H. Pylori регулируется напрямую и подавляется даже при следовых количествах железа. Позже транскриптомный анализ этого патогена предсказал 16 генов апо-Fur регулона, кодирующих белки, участвующие в хранении железа, дыхании, энергетическом обмене, хемотаксисе, что демонстрирует Fur-зависимую экспрессию (Lee,et al., 2007).

Хотя регуляция апо-формы Fur спорный вопрос, есть данные о том, что такая форма регулирует не только sodB и prf, но и hydA и ген цитохрома c553 в H. pylori (Carpenter et al., 2013). Репрессия апо-формой некоторых генов в условиях дефицита железа также отмечена в D. vulgaris Hildenborough (Bender et al., 2007) и N. gonorrhoreae (Yu, Genco, 2012). Кристаллизация апо-формы Fur C. jejuni показала, что ДНК-связывающий домен белка повернут на 180° по сравнению с полученными ранее данными о конформации димеров Fur других видов (Butcher et al., 2012). Такое различие голо- и апо-форм регулятора может вызывать узнавание различных последовательностей в промоторах целевых генов (Fillat, 2014). Таким образом, исследования в C. jejuni, N. gonorrhoeae и H. pylori показали, что апо-Fur может выполнять роль как активатора, так и репрессора (Butcher et al., 2012; Carpenter et al., 2013; Grifantini et al., 2003), как и в V. vulnificus, S. typhimurium и S. aureus и многих других апо-форма активирует fur (Lee et al., 2007), регулируемый железом белок IRO-28 (Hall et al., 1996) и norA (Deng et al., 2012).

Активация генов c Fe^{2 +}-объединенным Fur может происходить разными путями, не все до сих пор изучены. Прямая активация может быть связана с конкуренцией между Fur и другим репрессором, связывающимся с ДНК. Так происходит с геном norB, у которого Fur предотвращает связывание гомолога ArsR с сайтом, перекрывающимся с Fur-бокса (Isabella et al., 2008). Механизм опосредованной активации с помощью Fur описан у E. coli, где белок Fur сдвигает структурирующий белок, связанный с ДНК на промоторе гена ftnA, открывая таким образом доступ РНК-полимеразе (Nanda et al., 2010). Тем не менее, прямая инициация транскрипции с помощью Fur распространена шире. В P. aeruginosa Fe²⁺-Fur активирует ген бактериоферритина bfrB (Wilderman et al., 2004), в V. cholerae Fe²⁺-Fur активирует экспрессию гена порина в наружной мембране OmpT (Craig et al., 2011), у S. typhimurium Fe²⁺-Fur активирует транскрипцию фактора вирулентности hilD (Teixido et al., 2011). В Anabaena sp. PCC 7119 FurA играет двойную роль в регуляции транскрипции генов биосинтеза тетрапирольного пути: как железо-зависимый репрессор hemB, hemC и ho1, а также железо-зависимый активатор hemK и hemH (Gonzalez et al., 2012). Сравнительный анализ уровней транскрипции в мутанте с делецией fur у N. meningitidis выявил 38 Fur-активируемых генов (Delany et al., 2006), в то время как регулируемых Fe²⁺-Fur генов куда больше, связаны они с запасанием железа и его транспортом, энергетическим обменом и адаптациями (Yu, Genco, 2012). У H. pylori исследования Fur-регулона выявили 59 регулируемых генов, 25 из которых регулируются положительно, в том числе отвечающие за хемотаксис HP0295, fliY, flgK, cheA и ген основного флагелина flaB (Danielli et al., 2006). Дальнейшие исследования дополнили эту картину, показав прямую активацию Fe²⁺-Fur оперона oorDABC (Gilbreath et al., 2012), nifS (Alamuri et al., 2006) и гена cagA, участвующего в патогенезе (Pich et al., 2012). В случае E.coli Fe²⁺-Fur индуцируемыми генами оказались генв энергетического обмена, в основном кодирующие железо-содержащие белки дыхательных комплексов (McHugh et al., 2003). Все эти исследования свидетельствуют, что активация генов с помощью Fur распространенный механизм среди прокариот с различными физиологическими и метаболическими потребностями, тем не менее, некоторые целевые гены активируются за счет репрессии Fe-Fur небольших регуляторных РНК. Открытие первой из таких некодирующих РНК, RyhB, объяснило механизм активация гена железо-содержащего белка SodB у E.coli и показало, что RyhB также опосредует регуляцию acnA, fumA и bfr белком Fur (Masse, Gottesman, 2002). Это открытие показало механизм взаимодействия между снижением содержания железа в окружающей среде и замедлением железо-зависимых метаболических путей, процесс получил название «железо-запасающий ответ». Понимание роли малых регуляторных РНК в Fur-модуляции возросло с открытием ортологов RyhB у большого числа родов (http://rfam.xfam.org/family/RyhB#tabview=tab1), в том числе таких как Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter и Salmonella, а также у V. cholerae and Yersinia pestis (Oglesby-Sherrouse et al, 2013). Функциональные аналоги RyhB, не имеющие гомологии последовательностей, были найдены у многих бактерий. У P. aeruginosa найдено две регуляторных РНК, участвующих в регуляции метаболизма железа, названные PrrF1 и PrrF2 (Wilderman et al., 2004). РНК NrrF и Arrr участвуют в железо-запасающем ответе у Neisseria spp. (Ducey et al., 2009; Mellin et al., 2007; Metruccio e al., 2009) и Azotobacter vinelandii (Jung, Kwon, 2008), в то время как в грамм-положительной B. Subtilis для эффективной регуляции гомеостаза железа используется РНК FsrA (Gaballa et al., 2008). Недавний сравнительный полногеномный анализ девяти протеобактерий выявил 38 «новых» некодирующих РНК, регулирующих Fur (Sridhar et al., 2013), что свидетельствует о распространенности подобного механизма регуляции.

Fur как окислительно-восстановительный сенсор

Контроль метаболизма железа напрямую влияет на окислительно-восстановительный потенциал в клетке, поэтому требует тонкой настройки, сбой в такой регуляции может привести к гибели клетки. Сверхэкспрессия Fur приводит к окислительному стрессу (Lopez-Gomollon et al., 2009; Zheng et al., 1999), поэтому окисленность цистеина в Fur, видимо, играет важную роль у Streptomyces и цианобактерий (Fillat, 2014). Активность FurS у S. reticulii зависит от состояния цистеина и, как и PerR, белок может быть активирован как Fe²⁺, так и Mn²⁺ (de Orue et al., 2000). Тем не менее, пока неясно, способен Fur воспринимать окислительные сигналы как физиологический параметр или это результат случайного столкновения с радикалами (Spiro, D’Autreaux, 2012). Существует ряд организмов, у которых не найдены ортологи PerR, а функция ответа на окислительный стресс выполняют паралоги Fur, примером может служить Anabaena sр. PCC 7120, у которой FurА регулирует ряд генов, ортологи которых в других организмах являются целями PerR. Кроме того, функционирование FurA явно связано с окислительно-восстановительным потенциалом среды (Hernandez et al., 2004; Hernandez et al., 2006).

Кроме того, Fur функционально взаимодействует с геммом, который сам по себе катализирует образование АФК и является сигналом окислительно-восстановительного стресса. Этот кофактор обычно связывается с гистидинами или цистеинами гемма-белков. В дополнение к своим окислительно-восстановительным функциям гемм может работать как сенсор различных газов (таких как O₂, NO или CO) за счет молекулярных взаимодействий с гемм-чувствительными белками (Igarashi et al., 2011).

Fur контролирует много генов, участвующих в поглощении и деградации гемма у большинства бактерий. Высокое сродство одной молекулы гемма к димеру Fur у E.coli предотвращает встраивание в центр цинка или марганца, что указывает на потенциально важную роль комплекса Fe²⁺-Fur в регуляции метаболизма (Smith et al., 1996). Другой тип взаимодействия встречен у Anabaena sр. PCC 7120, где взаимодействие Fur с геммом приводит к потере сродства к ДНК (Hernandez et al., 2004). В отличие от E.coli, здесь Fur содержит цистеин-пролиновый участок, связывающий гемм. Спектроскопические исследования подтвердили участие цистеина в качестве одного из аксиальных лигандов гемма, а также его роль в качестве чувствительного к окислительно-восстановительному потенциалу клетки триггера (Pellicer, et al., 2012). Таким образом, гемм может выступать в качестве окислительно-восстановительного сигнала в цианобактерии Anabaena sр. PCC 7120. Ведутся дальнейшие исследования способности гемма опосредованно через Fur регулировать анаэробное дыхание в других организмах (Yang et al., 2013; Teixido et al., 2010).

Окислительные повреждения особенно опасны для фотосинтезирующих организмов, у которых железо-серные белки обоих фотосистем богаты лабильными кофакторами. У азотофиксирующих цианобактерий эффективные окислительно-востановительные сигнальные пути необходимы не только в вегетативных клетках, но и в гетероцистах, где нитрогеназа требует анаэробных условий. Последние данные свидетельствуют о важной роли FurA в Anabaena sр. PCC 7120 в поддержании окислительно-восстановительного гомеостаза. Помимо активности транскрипционного фактора у FurA была предположена активность дисульфид-редуктазы (Fillat, 2014).

Как и большинство белков семейства FurA Anabaena sр. PCC 7120 содержит два мотива CXXC, схожие содержат тиол-дисульфид оксидоредуктазы и тиоредоксин-подобные белки. Кроме того, терминальные цистеины обоих участков в FurA окружены лизином, позволяя стабилизировать тиоизоляты (Benoit, Auer, 2011). В отличие от ортологов, описанных на сегодняшний день, FurA не способен связывать цинк, что предположительно влияет на его способность к улавливанию окислительно-восстановительного состояния в клетке (Botello-Morte et al., 2014). Подобное зондирование в естественных условиях предполагает формирование внитримолекулярного дисульфидного мостика в окисленных условиях. FurA обладает свойствами дисульфид-редуктазы in vitro, чего не было обнаружено у Fur-белков гетеротрофных организмов L. monocytogenes и H. pylori (Botello-Morte et al., 2014). Новая ферментативная активность, которая пока специфична для FurA Anabaena sр. PCC 7120, иллюстрирует многофункциональность этого регулятора и его связи с окислительно-восстановительными сигнальными путями цианобактерий.

Регуляция Fur

Регуляция Fur широко исследуется и представляется довольно сложной и разнообразной в зависимости от метаболизма объекта. В дополнение к саморегуляции отмечено взаимодействие с другими регуляторными факторами. Пересечение взаимодействий Fur с другими регуляторными белками влечет за собой участие Fur в различных регуляторных цепях. Как правило, железо влияет на экспрессию fur, но у P. aeruginosa в промоторе fur не найдено последовательностей Fur-бокса, и ни один из двух независимых промоторов, контролирующих его транскрипцию, не зависит от железа (Vasil, Ochsner, 1999). Burkholderia pseudomallei содержит в геноме гомолог fur, уровень мРНК которого не меняется после индукции различными окислителями в варьирующих концентрациях железа(Loprasert et al., 2000). В C. jejuni ген fur также экспрессируется с двух независимых промоторов (van Vliet et al., 2000), хотя ко-репрессия промотора perR в мутанте по fur может быть вызвана тем фактом, что оба паралога совместно регулируют ответ на железо и окислительный стресс (Holmes et al., 2005). В V. Cholerae транскрипция fur слабо регулируется железом (Litwin et al., 1992). Тем не менее, экспрессия fur:: luxAB находилась под сильным слиянием фактора сигма S, продукта гена rpoS, который позитивно регулировал fur путем прямого взаимодействия в условиях дефицита железа (Lee et al., 2007; Lee et al., 2003).

Голодание по железу усиливает экспрессию Fur у большинства энтеробактерий, грамм-положительных и цианобактерий. Помимо железа, на экспрессию fur влияют окислительный стресс, низкий pH, углерод, азот. У H. pylori Fur имеет сродство к трем операторам в промоторе собственного гена, тонко регулируя экспрессию в ответ на количество железа. Важным элементом является оператор III, расположенный выше всех остальных, выполняющим роль анти-репрессора, связывающим апо-форму Fur для запуска транскрипции (Delany et al., 2003). В дополнение к этому, экспрессия fur у H. pylori подавляется в кислой среде для возможности запуска некоторых генов патогенности в соответствии с его функцией обуславливать устойчивость к кислотам (Bijlsma et al., 2002).

Из-за тесной связи гомеостаза железа с окислительным стрессом, Fur во многих организмах вовлечен в регуляцию ответов на пероксид водорода, индуцируя экспрессию PerR и OxyR. В S. aureus PerR Mn-зависимый репрессор генов, кодирующих ряд антиоксидантов, железо-запасающих белков, а также Fur и сам PerR (Horsburgh et al., 2001).

В E. coli активность Fur является результатом взаимодействия многих факторов, контроль осуществляет не только доступность железа, но и OxyR и SoxRS, которые активируют экспрессию Fur (Zheng et al., 1999). Кроме того, доступность углерода клетке также влияет на поглощение железа и наоборот, что является результатом функционального взаимодействия между регуляторными факторами Crp и Fur в E.coli (Zhang et al., 2005). Молекулярный анализ также свидетельствует о взаимном регулировании Fur и небольшого регуляторного белка Crl, который обусловливает сродство Fur к своему собственному промотору. С Crl также взаимодействует ассоциированный со стрессом сигма-фактор RpoS, триаду RpoS -Crl-Fur рассматривают как ключевой элемент в ответе на различные виды стресса (Lelong et al., 2007).

Следующий тип регуляции связан с пост-транскрипционным уровнем и некодирующими РНК. В E.coli транскрипция fur пересекается с транскрипцией лежащей выше РНК RyhB (Vecerek et al, 2007). Кроме того, цис-действующие антисмысловые РНК, комплементарные последовательности гена fur были идентифицированы в нескольких одноклеточных и ниточных цианобактериях (Hernandez et al., 2006; Sevilla et al., 2011). Супрессия α-fur РНК в Anabaena sр. PCC 7120 приводит к увеличению внутриклеточной концентрации железа и другим плейотропным эффектам (Hernandez et al., 2010). Кроме того, вдвое усиливается экспрессия Fur в условиях дефицита железа (Hernandez et al., 2002; Martin-Luna et al., 2006). α-fur РНК также были найдены у цианобактерии Microcystis aeruginosa PCC 7806 и Synechocystis sp. PCC 6803 (Sevilla et al., 2011, Martin-Luna et al., 2011).

У цианобактерий и E.coli были обнаружены примеры посттрансляционной модификации белков. В Anabaena sр. PCC 7120 связывание FurA и FurB с геммом уменьшает сродство комплекса к ДНК (Lopez-Gomollon et al., 2009; Hernandez et al, 2004). Посттрансляционная модификация Fur в E.coli возникает в ответ на нитридный стресс и заключается в прямом ингибировании регулятора путем связывания кофактора Fe²⁺ (D’Autreaux et al., 2002). Комплекс Fe-Fur-NO, вероятно, подвергается конформационному изменению, которое инактивирует димер, подобная форма не способна к связыванию с ДНК in vitro. in vivo NO вызывает дерепрессию Fur-регулируемых промоторов в E.coli. Подобный механизм так же был отмечен у S. aureus (Richardson et al., 2006), S. enterica (Crawford et al., 1998) и B. subtilis, у которых рост клеток с NO приводит к дерепрессии генов Fur-регулона, а также инактивирует железо-зависимый паралог PerR. Интересно, что в условиях, способствующих включению Mn в центр белка, PerR регулон становится нечувствительным к NO, что указывает на то, что только форма белка, содержащая железо является NO-чувствительной (Moore et al., 2004).

Таким образом, регулирование Fur является многофакторным процессом, который включает в себя различные экологические сигналы (такие как наличие железа, окислительный стресс и чувствительность к NO, углерод и концентрация азота и др.), а также участие различных регуляторных элементов других метаболических путей. Эти функциональные взаимодействия, а также взаимные влияния с другими регуляторами для тонкой настройки генов и различных оперонов свидетельствуют о центральной роли Fur в регуляторных сетях прокариот.