9.5 Основні етапи мікроклонального розмноження.

По своїй суті Мікроклональне розмноження аналогічне негативному типу розмноження рослин, звіюю лише різницею, що воно відбувається в пробірці в умовах in vitro, де з клітин ізольованих тканин можна одержати досить велику кількість нових рослин. На сьогодні кількість видів, що можна клону вати у пробірці становить понад 1 тисячу штук рослин. Більше 100 видів мають комерцій не застосування. Основна перевага методу в порівнянні з класичними методами – у вищому коефіцієнті розмноження. Мільйон рослин можуть вирощуватися у лабораторії площею 150-200 м2 .

9.6 Фактори, що впливають на процес мікроклонального розмноження.

Вибір материнської рослини. Бажано, щоб вихідні рослини не були ушкоджені грибними, бактеріальними і вірусними хворобами. Цибулини, кореневища і бульби попередньо обробляють високими або низькими температурами протягом різного часу – від кількох годин до кількох місяців. Вибір експланта. Для забезпечення ммаксимальної генетичної стабільності клонованого матеріалу і зметою уникнення появи аномальних рослин, як вихідний експлант використовують молоді, слабко диференційовані тканини. Для цього най придатні кінчики стебел,бічні пазушні бруньки, зародки і інші меристемні тканини. Можна використовувати молоді листки, черешки, суцвіття, денце цибулини. Стерилізація вихідного матеріалу. Для знезаражування вихідних експлантів використовують загальноприйняті методи. Проте часто внутрішнє зараження вихідних експлантів буває набагато сильнішим, ніж поверхневе, тому експланти попередньо обробляють фунгіцидами й антибіотиками проти грибної і бактеріальної хвороб.

9.7 Одержання безвірусного посадкового матеріалу.

Невеликий розмір експланту для клонального мікророзмноження, поверхнева стерилізація його, асептичне перенесення на живильне середовище і субкультивування в умовах, що виключають інфікування, призводять до оздоровлення отриманих рослин від нематод, грибних і бактеріальних патогенів. Але цього недостатньо для оздоровлення створеного клональним мікророзмноженням садивного матеріалу від вірусів, віроїдів, мікоплазм. Саме вірусні хвороби – причина втрати від 10 до 50 % врожаю сільськогосподарських культур, що розмножуються вегетативно. 49 Більш того, відомо, що соя, цукровий буряк і деякі інші важливі рослинні культури передають віруси нащадкам і при насінному розмноженні, тобто сорти поступово накопичують вірусні інфекції. Результати досліджень показують можливість боротьби з вірусами томатів і огірків у захищеному грунті за допомогою вакцинації рослин непатогенними вірусними штамами, мутантами вихідних патогенних. Вітчизняні вакцинні штами S7 і V – 69, отримані у ВІЗР й Інституті загальної генетики РАН, захищають врожай багатьох сортів томатів, що уражуються ВТМ. Збільшення врожаю для таких сортів складає приблизно 23%. Одержані стійких до вірусів сортів гібридизацією за стійкими дикими видами – шлях довгий, особливо якщо необхідно перенести гени стійкості до кількох найбільш хвороботворних вірусів. За допомогою генної інженерії створені рослини тютюну і томатів, стійкі до ВТМ і вірусу мозаїки люцерни. Створення безвірусного садивного матеріалу багатьох сільськогосподарських рослин залишається актуальною задачею клітинної біотехнології. Найбільш ефективний для досягнення цієї мети засіб – культивування меристем стебла або органів стеблового походження. У деяких випадках метод культури меристем доповнюють термотерапією. Фахівці з культури тканин і клітин уже давно навчилися вирощувати рослини з апікальної меристеми, що складається з конуса наростання й одного або двох листкових зачатків. Можна створити умови і для одержання рослини з тканини тільки конуса наростання без листкових зачатків. Проте чим більший розмір меристемного експланту, тобто чим більше листкових зачатків і тканин стебла він має, тим легше іде процес морфогенезу, що закінчується одержанням цілої, нормальної пробірочної рослини. Водночас зона, вільна від вірусних часток, дуже різноманітна для різних вірусів. Це залежить також від виду і сорту рослини. Так, при вичлененні під бінокулярним мікроскопом меристеми картоплі розміром 0,2 мм (конус наростання апексу з одним листковим зачатком) серед отриманих рослин тільки 10% були вільні від Х – вірусу, але 70% - від У-вірусу картоплі. Обираючи розміри меристемного експланту, фахівець-біотехнолог повинен враховувати можливості прийнятого методу одержання максимального числа рослин при максимальному відсотку безвірусних. Біотехнологи віддають перевагу використанню гранично малого розміру експланта (0,075 – 0,1 мм) і розробляють оптимальні умови для одержання нормальної пробірочної рослини. Іноді віддають перевагу поєднанню термотерапії і культури меристем. Попередня термотерапія вихідних рослин дозволяє одержувати оздоровлені від вірусів при використанні меристем них експлантів розміром 0,3- 0,8мм. Проте застосування термотерапії в ряді випадків призводить до відставання у рості і деформації органів меристем них рослин. Цей методичний прийом може також збільшити латентні вірусні інфекції. Все це змусило шукати і інші засоби ефективності виходу оздоровлених меристемних рослин. Було використано багато речовин для оптимізації методу культивування меристем у сполученні з хіміотерапією . Останнім 50 часом отриманні позитивні результати при внесенні в живильне середовище, на якому культивують меристеми аналогу гуанозина- 1р-Д-рибофуранозил- 1,2,4-триазол-карбоксаміда. Цей препарат, що одержав комерційну назву “вірозол” (синтетичний рибавірин), доданий до живильного середовища концентрації 40-200мМ, збільшував відсоток безвіусних меристем них рослин для ряду звичайних для цих рослин вірусів до 80-100% при 0-41% у контролі. Для технології оздоровлення посадкового матеріалу від вірусів вузьким місцем є відсутність високо специфічних і високочутливих діагностикумів на вірусні інфекції. Використання імуноферментної техніки, особливо в її мікро варіанті, застосування моноклональних антитіл, метод молекулярної гібридизації мічених фрагментів РНК і кДНК віроїдів і врусів з вірусами об’єкта, що тестується, дозволяє посто і швидко виявити присутність патогенів у крапельці екстракту з рослини, - ці методи задовольняють вимогам специфічності і чутливості. Проте при цьому може значно зрости вартість тестування і ціна оздоровленої рослини. Необхідно оцінити, при якому співвідношенні клонального розмноження оздоровлених рослин in vitro і in vivo будуть меншими витрати на діагностику. Оздоровлені застосуванням меристемної культури рослини розмножують далі звичайним методом клонального мікро розмноження . Метод клонального мікророзмноження має велике значення для оздоровлення вихідного рослинного матеріалу. Боротьба з вірусними хворобами багатьох сільськогосподарських культур – одна з найбільш актуальних проблем рослинництва в усьому світі, тому що з виробництва можуть випадати цінні сорти рослин. Крім методу культури меристем одержати здоровий посадковий матеріал можна і шляхом регенерації рослин з калусних , суспензійних і протонластних культур. Однією з важливих умов при одержанні безвірусного посадкового матеріалу є наявність надійних методів тестування вірусів .