Вопрос№3и4

1. Молекула ДНК представляет собой спираль, образованную 2 полинуклеотидными цепями, за­крученными относительно друг друга и вокруг об­щей оси (рис. 3.1).

2. Первичная структура цепей ДНК — это порядокчередования дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (dNMP) в полинуклеотидной цепи. Мононуклео-тиды связываются между собой 3',5'-фосфодиэфир-ными связями. Концы полинуклеотидной цепи раз­личаются по структуре: на 5'-конце находится фосфатная группа, на З'-конце цепи — свободная ОН-группа.

3. Полинуклеотидные цепи в двухцепочечной мо­лекуле ДНК расположены антипараллельно. Цепи удерживаются относительно друг друга за счет водо­родных связей между комплементарными азотистыми основаниями А-Т и G-C. Комплементарные основания лежат в одной плоскости, которая прак­тически перпендикулярна главной оси спирали.

Между основаниями двухцепочечной молекулы возникаютгидрофобные взаимодействия, стабили­зирующие двойную спираль.

Цепи комплементарны, но не идентичны друг другу,нуклеотидный состав цепей различен.

4.     Каждая молекула ДНК упакована в отдельную хромосому. Х ромосомы содержат разнообразные белки, связанные с определенными последователь­ностями ДНК. Все связывающиеся с ДНК эука-риотов белки можно разделить на 2 группы: гистоны и негистоновые белки. Комплекс белков с ядерной ДНК клеток называют хроматином.

5.     Питоны — это белки небольшого размера (мол. масса около 20 000) с очень высоким содержанием положительно заряженных аминокислот (лизина и аргинина). Хроматин содержит 5 типов гистонов: Н2А, Н2В, НЗ, Н4 (нуклеосомные гистоны) и HI. Суммарный положительный заряд позволяет им прочно связываться с ДНК (рис. 3.2). Фрагмент ДНК (146 пар нуклеотидов) взаимодействует с комплексом гистонов (нуклеосомный кор), образуя нуклеосомы. Гистоны HI связываются с ДНК в межнуклеосомных участках (линкерных последовательностях) и защи­щают эти участки от действия нуклеаз.

6.     Негистоновые белки — это разные типы регуля-торных белков, связывающихся со специфически­ми последовательностями ДНК, а также фермен­ты, участвующие в матричных биосинтезах.

7.     Первичная структура РНК — это порядок че­редования рибонуклеозидмонофосфатов (NMP) в полинуклеотидной цепи. Мононуклеотиды свя­зываются между собой 3',5'-фосфодиэфирными связями. Различают тРНК, мРНК и рРНК; все типы РНК имеют одну полинуклеотидную цепь.

8.     Отдельные участки цепей РНК образуют спи-рализованные петли — «шпильки» — за счет водо­родных связеймежду комплементарными азотис­тыми основаниями A-U и G-C.

Методы изучения днк

1. Для выделения ДНК из гомогената тканей уда­ляют фрагменты клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования. Белки, разрушенные протеазами (чаще всего применяют протеиназу К), экстрагируют из раствора. Затем ДНК осаждают, на­пример, этанолом и после удаления надосадочной жидкости ДНК растворяют в буферном растворе.

2. Молекула ДНК среднего размера содержит 150 000 000 нуклеотидных пар и имеет длину 4 см. Поэтому молекулы ДНК чувствительны к сдвиго­вым усилиям, возникающим в растворе, и в процессе выделения ДНК из тканей она фрагменти-руется. Получаются молекулы ДНК значительно меньше исходных, но все равно очень большие — тысячи или десятки тысяч пар нуклеотидов. Такие молекулы неудобны для исследований, и их при­ходится дополнительно фрагментировать.

Для фрагментирования используют рестриктазы — ферменты, выделяемые из бактерий. У бак­терий эти ферменты участвуют в уничтожении чужеродных для них ДНК. Рестриктазы «узнают» специфические последовательности из 4—6 нук­леотидов (сайты рестрикции), которые встреча­ются в ДНК человека. Известно множество раз­личных рестриктаз, причем каждая из них «узнает» свой сайт рестрикции (рис. 3.3).

С помощью набора рестриктаз можно разрезать молекулу ДНК на фрагменты желаемой длины. На­пример, для изучения первичной структуры удобны фрагменты размером около 300 нуклеотидных парн.п . Следовательно, цельную молекулу ДНК в 150 000 000 н.п. нужно разрезать на 500 000 фраг­ментов и каждый из фрагментов изучать отдельно.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для прове­дения некоторых исследований необходимо боль­шое количество хорошо очищенной высокомоле­кулярной ДНК. Метод П ЦР дает возможностьизбирательно синтезировать in vitro небольшие уча­стки ДНК и получить за 3—4 ч несколько миллио­нов копий исследуемого фрагмента. Объектами для выделения ДНК могут быть кровь, биоптат ткани, слюна, моча, околоплодные воды и т.д. Подробно этот метод и его применение в ДНК-диагностике будут рассмотрены в теме 3.10.

Гибридизация. Для изучения видовой специфично­сти нуклеиновых кислот применяют метод гибриди­зации. Он основан на способности ДНК к денатура­ции при нагревании (80—90 °С) и ренативации при последующем охлаждении. Возможно использова­ние метода для проведения гибридизации ДНК-ДНК и ДНК-РНК. Методом гибридизации можно установить сход­ство и различия первичной структуры разных об­разцов нуклеиновых кислот.