3.31. Метод Тенфорда определения разности свободной энергии денатурированного и нативного белка по денатурации в растворе мочевины

Для изменения свободной энергии денатурации белка в растворе мочевины можно записать:

−ΔF_u = RTlnK_u = RTln , где и − концентрации денатурированного и нативного белка.

δ(ΔF) = ΔF_u - ΔF_{H O} = ΔF_Д – ΔF_N.

δ(ΔF) = .

n_i – число групп (звеньев) типа i в белке.

α_i – численный параметр, зависящий от степени доступности растворителю групп данного типа в нативной конформации.

ΔF_i – вклад групп типа i в свободную энергию перехода.

α_i (пептидн.) 0.5;

α_i (полярн.) 0.25;

α_i (гидроф.) 0.75;

ΔF_i определяется из данных о растворимости аминокислот в воде и в растворе мочевины данной концентрации. Для концентрации мочевины (C ), при которой [Д] = [N] (ΔF_u = 0), тогда

ΔF_{H O} =− δ(ΔF) =− .

3.32. Калориметрические измерения денатурационных изменений в белках

Денатурацию рассматривают как мономолекулярную реакцию перехода из нативного состояния белка (N) в денатурированное (Д):

N←→ Д

В калориметрии измеряют ΔН или ΔС_р, сопровождающие эти переходы. В соответствии с формулой Киргоффа изменение энтальпии при плавлении:

ΔН = , где Cp(T) − теплоёмкость при постоянном давлении.

В обычных измерениях подводят теплоту к образцу: и регистрируют скорость повышения температуры образца ( ).

Чувствительность микрокалориметров высокая, примерно 10^-7 Вт.

ΔС_pd – это разность теплоемкостей белка в нативном и денатурированном состояниях при температуре перехода Td.

ΔН_ден = - - = ΔН_d - ,

где ΔН_d − молярная энтальпия перехода.

Для энтропии:

ΔS_ден = - .

Свободная энергия Гиббса для процесса денатурации (ΔF_ден ) запишется в виде:

ΔF_ден = ΔН_ден - T₁ ΔS_ден = ΔН_d - .

Миоглобин

Миоглобин - сложный белок третьего уровня структурной организации. Состоит из одной полипептидной цепи (153 остатка). Третичная структура белка образована, главным образом, альфа-спиралями вторичной структуры, на которые приходится около 70 процентов АКО, остальные - на повороты и начальный и конечный участки. Белок содержит в себе так называемый ГЕМ- комплекс порфирина и иона железа в степени окисления +2.

Ион железа встроен в кольцо порфирина таким образом, что четыре координационные связи из шести затрачены на образование связей с атомами азота, еще одна связана с азотом имидазольного остатка ГИС полипептидной цепи (проксимальный Гистидин F8), а другая - также с имидазольным остатком другого ГИС (дистальный ГИС Е7). Молекула кислорода присоединяется между остатком дистального ГИС и железом. Изменения степени окисления железа при этом не происходит. Порфириновое кольцо (ГЕМ) частично погружено в молекулу белка. Молекула кислорода присоединяется к нему, входя как бы через открывающуюся дверцу. Пока остается неясным, дожидается молекула кислорода случайного открывания двери, или существует какой-то механизм, пропускающий кислород к нему.

Миоглобин сосредоточен, главным образом, в мышцах и его главной функцией является хранение кислорода. Скорость насыщения миоглобина кислородом намного превышает таковую для гемоглобина. Миоглобин мало приспособлен для транспортировки кислорода из легких в ткани, поскольку скорость отдачи кислорода в тканях невелика (при давлении 1 мм рт. ст. примерно половина миоглобина все еще не отдает кислород).

Вопросы транспортировки кислорода решаются при участии гемоглобина.