Динамика образования антител

Появлению сывороточных антител предшествует латентная фаза, которая продолжается несколько дней после введения антигена. Она сменяется быстрым подъемом содержания (титра) антител – экспоненциальная (логарифмическая) фаза. Далее следует период стабилизации, когда между синтезом и деградацией антител устанавливается относительное равновесие. Затем титр начинает падать, отражая элиминацию антигена и естественный катаболизм иммуноглобулинов1.

Реакции на первое и повторные введения антигена имеют существенные особенности, отражая развитие иммунологической памяти (рис. 4). Вторичный (анамнестический) ответ отличается укороченной латентной фазой, высокими титрами антител и более длительным периодом стабилизации. IgM-антитела, доминирующие в начале первичного ответа, сменяются антителами других классов, прежде всего IgG2. Переключение класса антител проявляется и на уровне рецепторов В-лимфоцитов: IgM-рецепторы, преобладающие в наивных В-лимфоцитах, при антигенной стимуляции сменяются рецепторами других изотипов. Качественные различия касаются и аффинности антител (т.е. сродста к антигену): она нарастает по ходу иммунного ответа и значительно выше у «анамнестических» антител, т.е. антител, образующихся при повторном введении антигена. Перечисленные особенности справедливы для реакций на Т-зависимые антигены, так как дифференцировка клеток В-памяти происходит при участии Т-хелперов.

Иммунологическая память основана на количественных и качественных изменениях клеток, чувствительных к антигену. Они сводятся к экспансии (расширению) клона клеток, способных к ускоренному синтезу высокоавидных (высокоаффинных) антител. Клетки памяти закрепляют результат антигензависимой дифференцировки лимфоцитов, которая выражается в перестройке рецепторов, сокращении спектра костимулирующих воздействий и готовности к более быстрому вхождению в клеточный (митотический) цикл. Имеет значение и то, что большинство В-лимфоцитов памяти оседает в костном мозге, испытывая влияние его микроокружения. Анамнестический ответ В-лимфоцитов зависит и от клеток Т-памяти. На это указывает то, что образование антител по вторичному типу происходит лишь в тех случаях, когда гаптен (В-эпитоп) связан с носителем Т-эпитопов, который уже побывал в контакте с иммунной системой. . Реакции на Т-независимые антигены лишены иммунологической памяти и, соответственно, количественных и качественных различий между первичным и вторичным иммунным ответом. В обоих случаях образуется одинаковое количество IgM антител с низкой аффинностью, которая в известной мере компенсируется поливалентностью IgM.

Проявления Т-памяти не менее показательны, чем анамнестическая гиперпродукция антител. Они выражаются в реакциях замедленной аллергии и Т-зависимой цитотоксичности (например, реакция на туберкулин у лиц, зараженных микобактериями туберкулеза; ускоренное отторжение аллогенных тканей, повторно трансплантируемых от того же донора).

Моноклональные антитела

Как уже говорилось, антитела, возникающие в результате реакции на антиген, представляют продукт многих клонов В-лимфоцитов и в этом смысле являются поликлональными. Наиболее очевидная причина – полиэпитопность антигенов, которая вызывает подключение В-лимфоцитов, чувствительных к разным антигенным детерминантам. Имеет значение и неодинаковое сродство В-рецепторов к однотипным эпитопам. Так или иначе, но иммунный ответ всегда сопровождается образованием антител разной специфичности, аффинности и изотипической принадлежности.

Логика получения моноклональных антител проста: необходимо изолировать единственную антителопродуцирующую клетку, обеспечив ее длительное размножение и функционирование. Напрямую сделать это невозможно, так как в искусственных условиях лимфоциты быстро погибают, а плазматические клетки вообще не делятся. Проблему удалось решить на основе соматических гибридов (гибридом) между В-лимфоцитами и опухолевыми клетками. В такой конструкции В-лимфоцитам (точнее их генам) отводится роль продуцентов антител, а опухолевые клетки обеспечивают выживаемость, так как практически бессмертны, обладая способностью к неограниченному числу делений. Источником опухолевых клеток служит миелома – злокачественная опухоль, состоящая из плазмоцитов1. Миеломные клетки – близкие родственники нормальных В-лимфоцитов и плазматических клеток и поэтому дают с ними стабильные гибриды.

Лекция 4. Антигенраспознающие молекулы иммунной системы:

РЕЦЕПТОРЫ ЛИМФОЦИТОВ

ГЛАВНЫЙ КОМПЛЕКС ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ

Рецепторы В-лимфоцитов (BCR1)

Иммуноглобулины (антитела) не только секретируются во внешнюю среду, но входят в состав плазматической мембраны В-лимфоцитов. В этом случае они функционируют как рецепторы, которые распознают антигены и запускают активацию клеток. До контакта с антигеном (наивные В-лимфоциты) преобладающим изотипом мембранных иммуноглобулинов является IgM (mIgM)2. В отличие от сывороточной (пентамерной) формы, mIgM представляет собой мономер, снабженный дополнительным гидрофобным доменом, который обеспечивает заякоривание на плазматической мембране3. По ходу иммунного ответа происходит смена изотипа рецепторов на IgG, IgA и IgE. Это совпадает с переключением класса секретируемых антител: после короткого IgM-всплеска начинают доминировать IgG-антитела. При повторном контакте с антигеном IgG-антитела преобладают с самого начала, отражая перестройку рецепторов в клетках памяти. Специфичность рецепторов каждой клетки одинакова, совпадая со специфичностью секретируемых антител. Это связано с унификацией и уникальностью генов, детерминирующих синтез иммуноглобулинов дискретными клонами лимфоцитов.

Рекогносцировочная функция иммуноглобулиновых рецепторов получает развитие благодаря трасляции антигенного сигнала внутрь клетки. В этом участвуют две вспомогательных молекулы, контактирующие с mIg – CD79a и CD79b4. Их цитоплазматические фрагменты ассоциированы с внутриклеточны-ми ферментами (тирозинкиназами), активация которых запускает каскадный процесс, ведущий к поэтапному изменению экспрессии генов, т.е. к реакциям, характерным для рецепторзависимой стимуляции любых клеток. Здесь это вы-ражается в пролиферации и дифференицировке наивного В-лимфоцита в клет-ки-эффекторы (антителопродуцирующие плазмоциты) и клетки памяти.

Рецепторы Т-лимфоцитов (TCR1)

Мембранные структуры Т-лимфоцитов, распознающие антигены, имеют много общего с иммуноглобулинами и, следовательно, с рецепторами В-лимфоцитов. Рецептор большинства (более 95%) Т-лимфоцитов представляет гетеродимер, состоящий из двух пептидных (точнее гликопептидных) цепей – α и β (рис. 1). Они скреплены дисульфидной связью и имеют м. м. 40-50кДа. Каждая из цепей состоит из двух функционально различных участков – вариа-бельного ((Vα, Vβ) и константного (Сα, Сβ). Вариабельные участки оформлены в виде доменов, которые образуют антигенсвязывающий центр TCR. Это озна-чает, что они клоноспецифичны, т.е. отличаются у Т-лимфоцитов, реагирующих на разные антигены.

Так же, как у антител, структурная индивидуальность (клоноспецифичность) вариабельных доменов (Vα и Vβ) сконцентрирована в трех гипервариабельных участках – CDR1-CDR3 (от англ. Complementarity Determining Regions). Именно из их комбинации образуется «ловушка» для связывания антигена. Константные фрагменты (Сα, Сβ) обеспечивают фиксацию TCR на клеточной мембране и функциональные контакты с медиаторными (транслирующими антигенный сигнал) молекулами.

В отличие от рецепторов В-лимфоцитов, TCR не секретируются во внеш-нюю среду и не меняются в процессе иммуногенеза (отсутствие изотипии, по-стоянная аффинность). Но главной особенностью является механизм распозна-вания антигенов: мишенью для Т-лимфоцитов служат антигены, связанные с поверхностью собственных клеток; свободные антигены не воспринимаются. Информация о структурной чужеродности для Т-лимфоцитов формируется при участии мембранных молекул, “специализирующихся” на представлении (пре-зентации) антигенов. Они относятся к системе главного комплекса гистосовме-стимости – MHC (от англ. Major Histocompatibility Complex) и экспрессируются на поверхности антигенпредставляющих клеток, “прихватывая” фрагменты ан-тигенов. Не меняясь в классическом смысле, понятие “антиген” для Т-лимфоцитов является более сложным, чем для В-клеток, реагирующих на сво-бодные антигены. Полноценный Т-антиген представляет комплекс антигенно-го пептида (Т-эпитопа) и молекулы МНС. Только такая комбинация из “чужого” и “своего” воспринимается рецепторами Т-клеток. Это означает, что TCR обладает двойной специфичностью, или двойным распознаванием. Говорят также, что Т-лимфоциты рестриктированы по МНС, так как их реакции напрямую зависят от продуктов МНС-генов (лат. restrictio – ограничение). МНС-рестрикция нацеливает Т-лимфоциты на клетки, ставшие чужеродными и потенциально опасными для организма, устраняя (или по крайней мере сокращая) вероятность случайной атаки.

Восприняв информацию об антигене, TCR не может самостоятельно

превратить ее в сигнал, активирующий клетку. Для этого требуются вспомога-тельные (костимулирующие) молекулы. Наиболее тесной является связь между TCR и комплексом из четырех трансмембранных полипептидов (, ,  и ), собирательно обозначаемых как CD31. Они контактируют с С-участками TCR, улавливая конформационные изменения, вызываемые связыванием антигена МНС-пептида). Растормаживая активационный каскад, СD3-комплекс содей-ствует трансляции антигенного сигнала внутрь клетки, наполняя его функцио-нальным содержанием.

Формирование активационного сигнала зависит от прочности связи между TCR и МНС-презентируемым антигеном. В ее укреплении существенную роль играют корецепторы, прежде всего молекулы CD4 и CD8, альтернативно представленные на двух основных категориях зрелых Т-клеток (см. лекция 1). Они обладают сродством к молекулам МНС, многократно повышая эффективность антигенной стимуляции Т-лимфоцитов антигеном (см. рис. 2).

Главный комплекс гистосовместимости

Представления о главном комплексе гистосовместимости сложились при изучении судьбы аллогенных трансплантатов, т.е. органов и тканей, пересажи-ваемых в пределах одного вида животных. Они надежно приживаются лишь между изогенными (генетически идентичными) парами донор-реципиент. Это наблюдается между инбредными животными, а у человека – между однояйце-выми близнецами. В остальных случаях происходит более или менее быстрое отторжение донорских клеток на основе иммунологического конфликта с анти-генами реципиента. Антигены, определяющие наиболее сильную (острую) ре-акцию отторжения, получили название главных антигенов гистосовместимости. Они кодируются генами хромосомной области, которая известна как главный комплекс гистосовместимости – МНС (от англ. Major Histocompatibility Complex).

Продукты (антигены/молекулы) МНС отличаются необыкновенным поли-морфизмом, который вносит решающий вклад в антигенную индивидуальность (неповторимость) каждой особи1. В основе лежит изобилие аллельных МНС-генов, циркулирующих в популяции. Этому соответствует множество молекул МНС с признаками структурной (антигенной) специфичности. Из их случайной (малой) выборки складывается МНС-фенотип, присущий только данному организму.

МНС имеется у всех млекопитающих и птиц. У низших позвоночных он отсутствует, чему соответствует хроническое (а не острое) отторжение аллоген-ных тканей. Наиболее детально изучены МНС мыши и человека. Они имеют много общего, подчеркивая эволюционное единство иммунной системы.

Главный комплекс гистосовместимости человека (HLA)

МНС человека имеет акроним HLA (от англ. Human Leukocyte Antigens – антигены лейкоцитов человека). Это связано с тем, что они были впервые обнаружены на лейкоцитах человека в реакциях с сыворотками от многорожавших женщин и больных, получавших многократные гемотрансфузии. Такие сыворотки содержат антилейкоцитарные антитела, которые образуются в ответ на аллоантигены плода или доноров крови.

Комплекс HLA локализован на хромосоме 6, занимая область размером 3-46 пар нуклеотидов. Представления о масштабах HLA-генофонда заметно расши-рились с внедрением моноклональных анти-HLA антител и молекулярно-генетического анализа, т.е. прямого изучения HLA-генов. Согласно имеющимся данным комплекс HLA включает около 800 аллелей, альтернативное наследование которых обеспечивает беспрецедентную мозаику HLA-генотипов. В соответствии с генетической структурой HLA каждый индивид наследует около 20 аллельных генов (см. ниже). Благодаря столь малой выборке (20 из 800) вероятность полного совпадения индивидуальных HLA-генотипов (и, следовательно, HLA-фенотипов) ничтожно мала. Совпадение возможно лишь по отдельным аллелям или их комбинациям. Этим определяется вероятность относительно успешного приживления тканей в аллогенных парах «донор-реципиент».

Дополнительное разнообразие вносит диплоидность соматических клеток, благодаря которой каждая из них содержит по два комплекта МНС-генов, на материнской и отцовской хромосомах. Это означает, что индивид может иметь не более двух аллелей каждого HLA-гена (по одному на материнской и отцов-ской хромосомах) и, следовательно, не более двух разновидностей каждого HLA-антигена.

Набор генов одной хромосомы, называется гаплотипом (от греч. haplous – единственный). МНС-гаплотипы кодоминантны, т.е. одинаково влияют на фе-нотип клеток. Это означает, что HLA-фенотип (т.е. полный комплект молекул HLA, экспрессируемых клетками данного организма) является суммарным вы-ражением двух гаплотипов, унаследованных по материнской и отцовской ли-ниям.

МНС(HLA)-фенотип можно определить как уникальную совокупность поверхностных ан-тигенов, по которой клетки одного индивида отличаются от всех остальных особей данного вида животных. Следует понимать принципиальное различие между полиморфизмом молекул МНС и антигенных рецепторов В и Т лимфоцитов (BCR и TCR). В первом случае речь идет об аллотипии, связанной с альтернативным наследованием аллельных генов, циркулирующих в популяциях человека и животных; во втором – об идиотипии, т.е. о структурных вариантах одних и тех молекул, продуцируемых разными клонами клеток. Иными словами, идиотипия отражает гетерогенность молекул на уровне клеточных популяций, возникающую в результате мутаций и рекомбинационных перестроек генетического материала соматических клеток. Аллотипия определяется перетасовкой (рекомбинацией) генов в зародышевых клетках. Она связана с половым процессом и формируется на уровне «организменных» популяций.

Для всех видов животных характерно наличие двух основных классов МНС – МНС-I и МНС-II. При общей стратегии они различаются по генетиче-ской, структурной организации, тканевому распределению и функциям.

HLA-I. Молекулы I класса содержатся на поверхности клеток всех типов, кроме эритроцитов и ворсинчатого трофобласта. Они представляют гетероди-меры, состоящие из двух полипептидных цепей - тяжелой (46 кД) и легкой (12 кД) (рис. 1). Из них только тяжелая субъединица (α-цепь) является продук-том главного комплекса гистосовместимости, и именно с ней связаны иммуно-логические функции молекулы. α-цепь пронизывает плазматическую мембрану и имеет три внеклеточных домена – α1, α2 и α3. Вариабельность молекулы сконцентрирована в α1 и α2 доменах; домен α3 лишен полиморфизма.

Легкая (β) цепь представлена β2-микроглобулином. Это продукт гена, ко-торый локализован на хромосоме 15, т.е. не входит в состав комплекса HLA. β2-микроглобулин генетически однороден и напрямую не участвует в реализа-ции функций HLA-I. Его роль сводится к транспорту α-цепи на поверхность клетки (у мутантных мышей, лишенных β2-микроглобулина, молекулы I класса не экспрессируются). β2-микроглобулин не имеет трансмембранного участка, удерживаясь на мембране за счет нековалентной связи с α3-доменом1

Молекулы HLA-I представлены тремя наиболее важными подклассами – А (HLA-A), В (HLA-B) и С (HLA-C). Они кодируются одноименными генами, которым соответствует определенная позиция (локус) на хромосоме. По дан-ным молекулярно-генетического анализа общее число аллельных вариантов для генов HLA-1 приближается к 400 (HLA-A – 108, HLA-B – 223, HLA-C – 67). Количество известных HLA-1 антигенов гораздо меньше – около 100 (HLA-A – 28, HLA-B – 61, HLA-C –10)1. Они обозначаются цифрами, которые добавляются к буквенному обозначению подкласса (например, А1, В27, С8).

HLA-II. Молекулы II класса построены из двух нековалентно связанных пептидных цепей примерно одинакового размера – α (35 кД) и β (28 кД). Обе они являются продуктами главного комплекса гистосовместимости и участву-ют в реализации его иммунологических функций. Каждая цепь состоит из двух внеклеточных доменов (α1-α2 и β1-β2), которые прочно фиксированы на клетках при помощи трансмембранного участка молекулы (рис. 8). Вариабельные последовательности входят в состав α1 и β1 доменов; α2 и β2 домены не имеют аллотипов.

В отличие от HLA-I, конститутивная (т.е. постоянная) экпрессия молекул II класса ограничена клетками иммунной системы, презентирующими антигены Т-хелперам. Это так называемые профессиональные антигенпредставляющие клетки – дендритные клетки, макрофаги, В-лимфоциты. Появление HLA-II на других клетках указывает на их активацию, т.е. является индуцибельным.

Подобно HLA-I, молекулы HLA-II представлены тремя основными под-классами – DR, DQ и DP. Гены, кодирующие их α- и β-цепи, сконцентрированы в одноименных локусах на 6-й хромосоме. Наиболее полиморфны гены β-цепей: они представлены 367 аллельными вариантами (DR – 249, DQ – 36, DP – 82). Гены α-цепей гораздо однороднее – 36 разновидностей (DR – 3, DQ – 20, DP – 13).

Ф

Эффект/функция	Цитокины (примеры)
Индукция иммунного ответа (участие в антигензависимой активации Т- и В-лимфоцитов – костимулирующий эффект)	ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-4, ИЛ-5, ИНФγ
Реализация Т-клеточного иммунитета (Т-зависимая активация макрофагов)	ИНФγ
Стимуляция гемопоеза (пролиферация и дифференцировка кроветворных клеток)	Колониестимулирующие факторы (Г-КСФ, М-КСФ, ГМ-КСФ), фактор стволовых клеток, ИЛ-7 (лимфопоетин)
Подавление гемопоеза	Хемокины (ИЛ-8, RANTES)
Флогогенная (провоспалительная) активность	ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, хемокины
Противовирусная активность		Интерфероны
Репарация (заживление ран)		ТФР, хемокины
Противовоспалительная и иммуносупрессорная активность		ИЛ-10, ИЛ-4, ТФР
Индукция апоптоза		ТНФ
Факторы репарации		Эпидермальный, эндотелиальный, фибробластный факторы роста