Метаболизм ароматических соединений (Лекция 10)

Один из способов образования ароматических колец связан с синтезом поликетидов. Однако более важное значение для большинства автотрофных организмов (Автотрофы (др.-греч. αὐτός – сам и τροφή – пища) – живые организмы, синтезирующие органические соединения из неорганических) имеет путь шикимовой кислоты:

Этот метаболический путь изучен в основном на мутантах Е. coli, Aerobacter aerogenes и Neurospora, полученных при облучении микроорганизмов ультрафиолетом. В 1950 г Дэвис, используя метод отбора с применением пенициллина, получил серию мутантов Е. coli, способных расти лишь в такой питательной среде, в которую добавлялись ароматические соединения. Многие мутанты нуждались в тирозине, фенилаланине, триптофане, п-аминобензойной кислоте и (в следовых количествах) в п-оксибензойной кислоте. Неожиданно оказалось, что потребность во всех пяти соединениях можно удовлетворить путем добавления шикимовой кислоты, в то время считавшейся редкой у растений кислотой.

Таким образом, шикимовая кислота, которая отнюдь не является ароматическим соединением, оказалась промежуточным продуктом в процессах биосинтеза трех ароматических аминокислот и других важных ароматических соединений.

Шесть углеродов бензольного кольца ароматических аминокислот происходят от четырех углеродов эритрозо-4-фосфата и двух из трех углеродных атомов фосфоенолпирувата (PEP). Начальная стадия биосинтеза состоит в конденсации эритрозо-4-фосфата с PEP. Хотя она во многом аналогична альдольной конденсации, механизм ее до настоящего времени не выяснен. У большинства бактерий и грибов имеются три изофермента, каждый из которых ингибируется по принципу обратной связи одним из трех продуктов – тирозином, фенилаланином или триптофаном. Образующийся (3-дезокси-2-кето-D-арабино-гептулозоновая кислота)-7-фосфат циклизуется в 5-дегидрохинную кислоту. Промежуточный енол легко конденсируется в соответствующий циклический продукт.

Стадия 4 является первой из трех реакций элиминирования, необходимых для получения бензольного ядра. Дегидратация облегчается присутствием карбонильной группы. После восстановления продукта в шикимовую кислоту (стадия 5) реакция фосфорилирования (стадия 6) создает условия для последующей реакции элиминирования фосфата. На стадии 7 конденсация с PEP добавляет три атома углерода, которые станут -, β- и карбоксильным атомами углерода в фенилаланине и тирозине.

После конденсации с PEP элиминирование фосфата дает в качестве продукта хоризмат (хоризмовую кислоту).

Хоризмовая кислота находится в узловой точке метаболизма. При нагревании она дает смесь префеновой кислоты и 4-оксибензойной кислоты. Стоит обратить внимание, что последняя реакция представляет собой простое элиминирование енолят-аниона из пирувата. Образование фенилпирувата (стадии 9 и 10) катализируется одним белком, обладающим двумя четко различающимися видами ферментативной активности. На каждой из этих двух стадий фермент хоризматмутаза-префенатдегидратаза ускоряет ход реакций, идущих спонтанно при нагревании в кислом растворе. Фенилпируват путем переаминирования легко превращается в фенилаланин, чем и завершается биосинтез этой аминокислоты.

Второй фермент – хоризматмутаза-префенатдегидрогеназа – вызывает окислительное декарбоксилирование префената в п-оксифенилпируват, который может путем переаминирования превращаться в тирозин. И в этом случае один фермент катализирует две стадии 9 и 11; по одной из своих активностей этот белок является изоферментом предыдущего белка, катализирующего стадии 9 и 10.

Исчерпывающее описание любого природного соединения возможно в том случае, если мы в деталях знаем процесс его биосинтеза и биохимического функционирования. Но, как правило, наши знания о биохимических превращениях некоторых редко встречающихся в природе соединений слишком ограниченны. К таким соединениям относятся нитро- и нитрозосоединения, среди которых встречаются антибиотики и канцерогенные вещества. Однако при изучении какого-либо биохимического процесса можно пользовать метод аналогий, и такой подход, конечно, вполне разумен, поскольку в природе все построено рационально.

АНТИБИОТИКИ

Хлорамфеникол

Среди природных нитросоединений наибольшее практическое значение имеет хлорамфеникол. Он является также первым природным продуктом, в котором обнаружена ароматическая нитрогруппа.

Хлорамфеникол получен в кристаллическом виде из культур Streptomyces venezuelae – плесени, впервые выделенной из почвы вблизи Каракаса, Венесуэла. Химическое строение хлорамфеникола установлено Ребстоком в 1949 г. Это соединение представляет собой D-(1)-трео-1-п-нитрофенил-2-дихлорацетамидопропандиол-1,3:

Из-за присутствия двух асимметрических атомов углерода в молекуле существуют D- и L-трео- и D- и L-эритро-изомеры, из которых только D-трео-изомер полностью активен как антибиотик.

Биосинтез хлорамфеникола являлся предметом многочисленных экспериментальных и теоретических исследований, и они привели к осуществлению крупномасштабного производства антибиотика уже в тот период, когда еще не существовало эффективных химических методов синтеза. Поскольку хлорамфеникол является продуктом микробиологического превращения, то, изменяя условия выращивания культуры и отбирая мутанты, можно максимально увеличить выход желаемого метаболита. Одно из важнейших условий выращивания культуры (которое можно легко варьировать) – присутствие специфических субстратов, способных выступать в роли достаточно эффективных предшественников метаболита.

На основе знания путей образования ароматических аминокислот было сделано предположение, что таким общим промежуточным продуктом может служить шикимовая кислота.

Хотя шикимовая кислота лишь в ограниченной степени используется видами Streptomyzes, она тем не менее является предшественником антибиотика хлорамфеникола. Более глубокие исследования меченых возможных предшественников привели к нахождению пути биосинтеза:

Достоверность схемы биосинтеза хлорамфеникол подтверждает тот факт, что -N-дихлорацетил-L-п-аминофенилсеринол был выделен из продуцирующей хлорамфеникол культуры Streptomyces venezuelae. Кроме того, установлено, что добавленные к культуральной среде D,L-терео-п-нитрофенилсерин и п-нитрофенилсеринол не расходуются на образование хлорамфеникола

поэтому можно заключить, что образование нитрогруппы является одной из последних стадий биохимического синтеза.

В 1949 г Ребсток не только установили структуру антибиотика, но и доказали ее синтезом. Одним из наиболее доступных веществ для получения левомицетина является стирол, который превращают либо в п-нитроацетофенон, либо в п-нитрофенилхлорметилкарбинол. Исходные соединения переводят в п-нитро--ацетиламиноацетофенон, из последнего далее по общей схеме синтезируют левомицетин.

Для получения п-нитроацетофенона стирол подвергают метоксихлорированию хлором в среде метанола; получаемый метиловый эфир хлоргидрина стирола нитруют смесью азотной и серной кислот, а образовавшуюся смесь нитроизомеров подвергают обработке щелочью и выделяют п-нитро--метоксистирол, при гидролизе последнего в присутствии серной кислоты образуется п-нитроацетофенон.

Далее п-нитроацетофенон превращают в левомицетин по следующей схеме.

На первой стадии п-нитроацетофенон бромируют до п-нитро--бромацетофенона, из которого без выделения получают уротропиновую соль, при гидролизе которой образуется гидрохлорид п-нитро--аминоацетофенона. Последний на следующей стадии ацетилируют уксусным ангидридом в присутствии основных агентов, образующийся п-нитро--ацетиламиноацетофенон при взаимодействии с формальдегидом в присутствии углекислого натрия дает п-нитро--ацетиламино-β-оксипропиофенон. Кетон восстанавливают смесью изопропилата и хлордиизопропилата алюминия в смесь диастереоизомерных D,L-1-(п-нитро)-2-ацетиламино-1,3-пропандиолов трео- и эритро- ряда. Применение определенных условий восстановления обеспечивает преимущественное образование нужного трео-изомера.

Далее смесь D,L-трео изомеров подвергают гидролизу соляной кислотой, при этом получают кристаллический гидрохлорид D,L-трео-1-(п-нитрофенол)-2-амино-1,3-пропандиола. Основание последнего, выделенное из гидрохлорида, взаимодействием с метиловым эфиром дихлоруксусной кислоты превращают в рацемат левомицетина – синтомицин.

Для получения левомицетина основание D,L-трео-1-(п-нитрофенол)-2-амино-1,3-пропандиола предварительно делят на оптические антиподы: D(–) и L(+). Дихлорацетилирование D(–) изомера приводит к образованию левомицетина.

Разделение D,L-трео-1-(п-нитрофенол)-2-амино-1,3-пропандиола на антиподы может быть осуществлено как с применением D-винной кислоты, так и посредством поочередной кристаллизации основания D(–) и L(+) из воды в присутствии его гидрохлорида. Второй метод значительно удобнее первого.

По другому методу п-нитро--ацетиламиноацетофенон из стирола получают по следующей схеме:

Стирол взаимодействием с хлорноватистой кислотой превращают в хлоргидрин стирола, которой далее нитруют концентрированной азотной кислотой. Образующуюся смесь нитроизомеров нитроэфира фенилхлорметилкарбинола без выделения омыляют до смеси нитрофенилхлорметилкарбинолов, из которой при действии водного раствора едкого натра получают смесь изомерных окисей нитростиролов. Из последней выделяют кристаллическую окись п-нитростирола. При действии жидкого аммиака на окись образуется 1-(п-нитрофенил)-2-аминоэтанол, дальнейшее ацетилирование которого приводит к 1-(п-нитрофенил)-2-ацетиламиноэтанолу, окислением последнего получают п-нитро--ацетил-аминоацетофенон.