З А Н Я Т И Е 1

Дата ______________

Тема: ООИ. Микробиологическая диагностика чумы, туляремии

План занятия:

1. Возбудитель чумы. Морфология - демонстрация готовых препаратов-мазков.

2. Знакомство со свойствами возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза.

3. Возбудитель туляремии. Морфология - микроскопия готовых препаратов-мазков из чистой культуры и из органов зараженных животных.

4. Правила взятия материала, пересылки в лабораторию и условия работы с возбудителями особо опасных инфекций.

5. Знакомство с иммунопрепаратами, применяемыми для диагности­ки, профилактики и лечения чумы, туляремии (диагностикумы, аллергены, вакцины, сыворотки).

Методические указания

1. Промикроскопировать готовые пре­параты-мазки возбудителя чумы и зарисовать в рабочую тетрадь. Обратить внимание на морфологию и тинкториальные свойства микроорганизма.

3. Промикроскопировать готовые пре­параты-мазки возбудителя туляремии из чистой культуры и из органов зараженных животных. Зарисовать в рабочую тетрадь. Обратить внимание на морфологию и тинкториальные свойства микроорганизма.

Возбудитель чумы Yersinia pestis	Возбудитель туляремии Francisella tularensis

Контрольные вопросы

Каковы морфологические особенности палочки чумы и ее культуральные свойства?

Что такое пестин и для какой цели он применяется?

Какой материал берется для бактериологического исследования при различных клинических формах чумы?

Какие микробиологические методы используются для диагностики чумы?

Каковы основные пути заражения человека возбудителем чумы?

Как осуществляется специфическая профилактика чумы?

Какие признаки используют для дифференциации возбудителя чумы от возбудителей ложного туберкулеза грызунов и кишечного иерсиниоза?

Какие подвиды чумных бактерий Вы знаете?

Каковы морфологические культуральные и биохимические свойства возбудителя туляремии?

Какой материал берется от больного при различных клинических формах туляремии? Каковы особенности выделения возбудителя туляремии от больного человека?

Какие микробиологические методы используются для диагностики ту­ляремии?

Как осуществляется серологическая диагностика туляремии?

Какие препараты используются для аллергической диагностики ту­ляремии? Как ставятся и оцениваются аллергические реакции?

На какой день заболевания рекомендуется ставить реакцию агглю­тинации и аллергическую пробу при туляремии?

Каковы общие правила взятия, пересылки материала и лаборатор­ного режима при особо опасных инфекциях? В чем заключаются особен­ности работы с больными чумой и зараженными животными?

Какие вакцины используются для профилактики чумы, туляремии и как они применяются?

Методы микробиологической диагностики чумы а. Бактериологический

Материал: от больных - пунктат из бубона, мокрота, кровь из вены; от трупов - кусочки органов, лимфоузлы, кровь, костный мозг.
Микроскопия			МПА и МПБ (с 0, 1% крови кролика или лошади, с 0,05% сульфита натрия и антифаговой сывороткой). Инкубирование при 25-30°C
Микроскопия	МПА
Пестрый ряд	Реакция агглютинации со специфической сывороткой	Отношение к специфическому фагу		Заражение морской свинки втиранием в кожу, подкожно, внутрибрюшинно

Б. Биологический

Исследуемый материал (см. метод А)

В. Аллергический

(для ретроспективной диагностики) – проба с пестином.

Г. Серологический

Применение иммунологических реакций для обнаружения антигенов возбудителя (РПГА и ее модификации, ИФМ, РИМ).

Методы микробиологической диагностики туляремии

А. Бактериологический и биологический

Материал: пунктат из бубона, гной из конъюнктивы, пленка из зева

Б. Серологический

Реакция агглютинации по типу реакции Райта (с 10-12 дня заболевания,

диагностический титр 1:100)

В. Аллергический

Аллергическая проба с тулярином – накожная и внутрикожная

(с 5-7 дня заболевания).

Приложение к ЗАНЯТИЮ 1

А. Иерсинии - возбудители псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis)

и кишечного иерсиниоза (Y. enterocolitica)

Эти два вида иерсиний играют значительную роль в патологии че­ловека. Бактерии представляют собой полиморфные, не образующие спор грамотрицательные палочки, имеющие часто овоидную форму. Клетки в старых культурах окрашиваются неравномерно. Бактерии псевдотуберкулеза, взятые с влажного агара, могут иметь биполярную окраску, об­разуют капсулу, но с различной степенью выраженности. Оба вида бак­терий обладают подвижностью, обусловленной наличием перитрихиальных жгутиков. Подвижность выявляется посевом в столбик полужидкого агара уколом, но только при 18-20ºC , при 37°C подвижность отсутствует.

Иерсинии неприхотливы к питательным средам, хорошо растут на обычных универсальных средах, способны активно размножаться в почве и воде. Оптимальная для роста температуре 30ºС, верхняя и нижняя границы роста составляют 43°С и 0-2°С соответственно, оптимум рН 6,6-7,8. На среде Эндо колонии имеют диаметр 0,1-0,2 мм, круглые вы­пуклые, блестящие с ровными краями, бесцветные (не ферментируют лак­тозы). Колонии возбудителя псевдотуберкулеза, находящиеся в R-форме, почти не отличаются от колонии возбудителя чумы (пигментированный центр и фестончатый "кружевной" край). Биохимические различия трех видов иерсиний представлены в таблице.

Все три вида иерсиний отличаются и по своим антигенным свой­ствам.

Возбудитель псевдотуберкулеза по O-антигенам разделяется на восемь групп (1-8) с 20 O-факторными антигенами (1-20). По O- и Н-антигенам (а-е) этот вид подразделяют на 13 сероваров и подсероваров (la, 1в, 2а, 2в, 2с, 3, 4а, 4в, 5а, 5в, 6, 7, 8).

Y. enterocolitica характеризуется антигенной неоднород­ностью по 0-антигену. В настоящее время различают более 30 сероваров этого вида. Большинство из них адаптированы к некоторым видам животных или широко распространены во внешней среде. Подавляющее большинство штаммов, выделенных от человека, принадлежат к сероварам 03 и 09, реже встречаются серовары 08, 05в и очень редко - серовары 01, 02, 06, 07, 010, 011, 013, 014, 015, 016, 017.

От людей, больных псевдотуберкулезом, чаще всего выделяются штаммы, относящиеся к серовару 1, реже 3 и 4.

В ходе эволюции у иерсиний закрепилась необходимость существо­вания в двух средах обитания - внешней (сапрофитическая фаза жизни) и в организме теплокровных животных и человека (паразитическая фаза). Для осуществления паразитической стадии иерсинии должны проникнуть в организм теплокровного животного. Заражение возбудителем псевдо­туберкулеза чаще всего происходит при употреблении в пищу инфициро­ванных иерсиниями продуктов, хранившихся при пониженной температу­ре (4-12ºС) в холодильниках и овощехранилищах. В этих условиях бак­терии в силу своей психрофильности могут размножаться и накаплива­ться в пищевых субстратах.

Иерсинии при пониженной температуре обладают высоким потенциа­лом клеточной и тканевой инвазивности и способны сохранять высокий уровень вирулентности, однако возбудитель может проникнуть в орга­низм человека и через любые слизистые оболочки, вероятно, за счет неспецифических механизмов.

Основным источником иерсиниозов являются дикие и синантропные грызуны, домашние и сельскохозяйственные животные. Возможно зара­жение человека от человека. Штаммы Y. pseudotuberculosis выделены от 175 видов млекопитающих, 124 видов птиц, 7 видов рыб. Зараженные грызуны, животные и люди выделяют возбудителя с испражнениями и мо­чой, загрязняя воду, растения и другие объекты внешней среды. Таким образом, пищевой путь в передаче возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза является ведущим. Заражение происходит в ре­зультате употребления в пищу сырых или недостаточно термически обра­ботанных продуктов (мяса, мясных продуктов, молока, овощей, фруктов, зелени). Оба вида возбудителя способны существовать внутри растений (салата, гороха, овса и т.п.).

Заболевания, вызываемые иерсиниями, характеризуются полиморфностью клинических проявлений, поражением желудочно-кишечного тракта, тенденцией к генерализации, септикопиемии и поражению различных ор­ганов и систем.

Патогенные свойства иерсиний обоих видов, как и возбудителя чу­мы, во многом определяются наличием у них плазмид с молекулярной массой 42-48 МД и 82 МД. Плазмиды контролируют такие свойства возбу­дителей, как зависимость роста от наличия в среде кальция, способ­ность синтезировать антигены вирулентности (v-w), пили адгезии, спо­собность вызывать кератоконъюнктивит у морской свинки и т.п.

Микробиологическая диагностика иерсиниозов включает использо­вание бактериологического метода и серологических реакций.

При бактериологическом методе исследуемый материал от больных (испражнения, кровь, слизь из зева), а также подозрительные продук­ты или воду засевают на среды Эндо, Плоскирева, Серова (индикатор­ную и дифференциальную) и инкубируют при 37°C в течение 48-72 часов.

Подозрительные колонии (мелкие бесцветные на средах Эндо и Плоскирева и окрашенные колонии двух различных форм на средах Серова) пересевают для получения чистых культур, которые идентифицируют по биохимическим признакам и окончательно типируют с помощью диагности­ческих агглютинирующих сывороток.

Для серологической диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза используют развернутую реакцию агглютинации (по типу реакции Видаля) с соответствующими диагностикумами или реакцию пас­сивной гемагглютинации (РПГА) с антигенным эритроцитарным диагностикумом. Положительными считают реакции при титре антител 1:400 и вы­ше. Реакции рекомендуется ставить с парными сыворотками (с интерва­лом в несколько дней). Нарастание титра антител будет свидетельство­вать о специфичности инфекционного процесса.

Б. Дифференциальные признаки биоваров Y. рestis

Признак	Биовары Y. pestis
	Y. antiqua	Y. mediaevalis	Y. orientalis
Ферментация:
глицерина	+	+	-
мелибиозы	-	+	-
Восстановление нитратов в нитриты	+	-	+
Область распространения:
Центральная Азия	+	-	+
Центральная Африка	+	-	+
Иран, Средняя Азия	-	+	+
Другие эндемичные регионы	-	-	+

В. Отечественная классификация вида Yersinia pestis (Саратов, 1985)

Y. pestis subsp. pestis - основной подвид

Y. pestis subsp. altaica - алтайский подвид

Y. pestis subsp. caucasica - кавказский подвид

Y. pestis subsp. hissarica - гиссарский подвид

Y. pestis subsp. ulegeica - улэгейский подвид

Г. Особенности генетического контроля факторов

патогенности у возбудителя чумы

Контроль наиболее важных факторов патогенности возбудителя чу­мы осуществляется плазмидами, на которых локализованы гены вирулентности. Известны три плазмиды, контролирующие важнейшие факто­ры патогенности возбудителя: рYР (м.м.6 МД); рYТ (м.м. 60 МД) и рYV (м.м. 47 МД).

Плазмида рYР (6 МД) несет гены, определяющие синтез пестицина. фибринолизина и плазмокоагулазы.

Плазмида рYТ (60 МД) несет детерминанты, контролирующие синтез антигена фракции I и "мышиного" токсина.

Плазмида рYV (47 МД) ответственна за синтез антигенов v и w и термоиндуцибельных белков внешней мембраны, а также зависимость роста чумной палочки от наличия в среде ионов Са⁺⁺.

Д. Основные различия между возбудителями чумы,

псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза

Признак	Вид возбудителя
	Возбудитель чумы	Возбудитель псевдотуберкулеза	Возбудитель кишечного иерсиниоза
Подвижность	-	+	+
Лизис а) индикаторным чумным фагом	+	-	-
б) псевдотуберкулезным фагом	-	+	-
Рост на голодно-кислой среде	-	+	+
Ферментация: рамнозы	-	+	-
маннита	+	+	+
мальтозы	+	+	+
сахарозы	-	-	+
Наличие: уреазы	-	+	+
аденозиндезаминазы	-	+
плазмокоагулазы	+	-	-
фибринолизина	+	-	-
фракции 1	+	-	-
Вирулентность: в S-форме	-	+	+
в R-форме	+	-	-

Е. Географические разновидности туляремийных бактерий

Расы	Ферментация глицерина	Наличие цитруллин-уреидазы	Патогенность для домашних кроликов и людей
Голарктическая раса (Европа, Азия) Francisella tularensis holarctica	-	-	умеренно патогенна
а) японский вариант - var. japonica	+	-	“
Среднеазиатская раса - Francisella tularensis mediasica	+	+	“
Неарктическая, или американская раса - Francisella tularensis nearctica	+	+	Относительно высокая патогенность для кроликов и людей

Ж. Ландшафтные типы природных очагов туляремии

Пойменно-болотный, луго-полевой, степной, лесной, предгорно-ручьевой, тугайный (пойменно-пустынный) и тундровый.

З А Н Я Т И Е 2

Дата ______________

Тема: ООИ. Микробиологическая диагностика бруцеллеза