Протокол практичного заняття №3.__”____”________200______ Робота1. Визначення групи крові за системою аво за реакцією аглютинації.

Для визначення групи крові в будь-якій системі використовують один і той же принцип: забезпечують умови для здійснення реакції аглютинації еритроцитів у середовищі стандартних ізогемаглютинуючих сироваток або цоліклонів, що мають високий титр антитіл до досліджуваних антигенів еритроцитів. Стандартні сироватки —це очищена в фабричних умовах плазма донорів різних груп крові, що не містить фібриногену та має високу концентрацію антитіл до одного або кількох антигенів однієї групової системи.

Цоліклони анти-А і анти-В являють містять специфічні імуноглобуліни, тобто антитіла, аглютиніни, які діють проти групових антигенів А і В. Ці антитіла утворюються одноклональними В-лімфоцитами у мишей при введенні в їх організм антигенів (А або В) у вигляді злоякісних специфічних клітин.

У цоліклонах є антитіла тільки однієї специфічності. Це означає, що вони дають реакцію лише на 1 антиген, тобто, не зумовлюють неспецифічної поліаглютинацїї еритроцитів. Ці їх властивості забезпечують перевагу перед стандартними сироватками, які важко очистити від інших антитіл і тому можливі неспецифічні реакції з антигенами досліджуваної крові.

Мета роботи: визначити групу крові за системоюАВ0.

Для роботи потрібні: біла фарфорова тарілка, 7 маркірованих піпеток, предметне скло, олІвець-склограф, кров та плазма обстежуваного, закриті посудини з розчинами цоліклонів анти-А та анти-В, стандартні еритроцити ІІ(А) та III(В), ізотонічний розчин натрію хлориду.

Хід роботи. Суху фарфорову тарілку розділити на 4 сектори, склографом. 3робити написи «анти-А», «анти-В», «стандарт А», «стандарт В». 3а допомогою відповідно маркірованих піпеток по черзі нанести на поверхню тарілки у відповідний сектор по одній (0,1 мл) краплі цоліклонів анти-А та анти-В. Простежити, щоб не було бризок до сусідніх секторів. Цією ж піпеткою зробити краплю плоскою (не менш ніж 1,5—2 см у діаметрі).

Одну краплю досліджуваної крові за допомогою відповідно маркірованої піпетки помістити на сухому предметному склі. Куточками другого сухого предметного скла перенести частину крові (0,01 мл) в обидві краплі цоліклонів. Куточки скла для різних цоліклонів мають бути різними. Кров одразу розмішати з краплею цоліклона цим же куточком предметного скла. Співвідношення крові й цоліклона повинно бути 1 : 10 (змішана крапля має слабко-рожеве забарвлення). Спостереження за перебігом реакції провести, погойдуючи тарілку протягом 2,5 хв.

Оцінка результатів та контроль.

1. Аглютинації еритроцитів немає ні з цоліклоном анти-А, ні з цоліклоном анти-В. Отже, можна припустити, що досліджувані еритроцити не містять антигенів А і В, а кров належить до групи 0,ab (I). Для підтвердження цього треба провести контроль на присутність у цій крові аглютинінів a, b.

Для проведення контролю треба за допомогою маркірованої піпетки нанести по 1 краплі плазми досліджуваної крові в сектори з написами «стандарт А» і «стандарт В». 3робити краплі плоскими (діаметром .1,5—2 см). Краплю крові зі стандартними еритроцитами групи А (II) помістити на предметне скло. Кутом другого предметного скла перенести частину крові в краплю плазми, що міститься в секторі «стандарт А». Співвідношення крові й плазми становить 1 : 10. Так само змішати стандартні еритроцити групи В (III) з плазмою досліджуваної крові в секторі з написом «стандарт В». Якщо буде реакція аглютинації в обох краплях плазми, то можна з певністю говорити, що кров обстежуваного належить до групи 0,ab(I) і містить в собі аглютиніни a, b.

2. Аглютинація еритроцитів відбулася лише з цоліклоном анти-А. Отже, можна припустити, що досліджувані еритроцити містять лише антиген А і кров належить до групи А, b (ІІ). Для підтвердження цього треба провести контроль з метою виявлення аглютинінів у плазмі досліджуваної крові.

Для проведення контролю за допомогою маркірованої піпетки треба нанести по 1 краплі плазми на тарілку в секторах з написом «стандарт В» і «стандарт А». 3мішати плазму й стандартні еритроцити А (II) і В (III) за описаною вище методикою. .Якщо аглютинація стандартних еритроцитів відбувається у секторі «стандарт В» і не проявиться у секторі «стандарт А», то це свідчить про те, що в плазмі є аглютиніни b, але нема аглютинінів a . Отже, можна стверджувати, що кров належить до групи А, b (II).

3. Аглютинація еритроцитів досліджуваної крові відбулася тільки з цоліклоном анти-В. Отже, можна припустити, що досліджувані еритроцити містять лише антиген В і кров належить до групи В, a (III). Для підтвердження цього слід провести такий же контроль, як у попередніх випадках. Якщо реакція аглютинації стандартних еритроцитів відбудеться у секторі «стандарт А» і не відбудеться у секторі «стандарт В», то можна стверджувати, що досліджувана кров належить до групи В, a (III)

4. Аглютинація еритроцитів спостерігається в обох краплях з цоліклонами анти-А і анти В. Отже, можна припустити, що еритроцити досліджуваної крові містять обидва антигени—А і В, а кров належить до групи АВ (ІУ). Для підтвердження цього також обов'язковий контроль, який проводять за вищеописаною методикою.

Якщо аглютинації стандартних еритроцитів не буде в обох краплях суміші з плазмою досліджуваного, то це означатиме, що плазма не містить антитіл ні a, ні b. Отже, досліджувана кров належить до групи АВ (ІУ).

При проведенні проб треба пам'ятати, що всі явища, які відбуваються у краплях більш ніж за 2,5 хв. від моменту змішування, не будуть пов'язані зі специфічною аглютинацією, котра визначається у досліджуванні, а можуть мати різні причини.

Несправжня аглютинація еритроцитів може бути тоді, коли вони збираються у монетні стовпчики. Цю аглютинацію легко відрізнити від справжньої. якщо додати до 1 краплі крові 1—2 краплі ізотонічного розчину натрію хлориду. У даному разі несправжня аглютинація зникне.

Результати роботи.

Реакція еритроцитів досліджуваної крові з цоліклонами		Реакція плазми досліджуваної крові зі стандартними еритроцитами		Досліджувана кров належить до групи
анти-А	анти-В	А(ІІ)	В(ІІІ)

Висновки: досліджувана кров належить до групи__________________________

Робота 2. Визначення загального часу зсідання крові

Мета роботи: визначити загальний час зсідання крові та оцінити його.

Для роботи потрібні: предметне скло, скляний гачок, годинник, голка, 96 % спирт етиловий, 2 % розчин йоду спиртовий, вата.

Хід роботи. З хвоста щура взяти кров і нанести на предметне скло краплю крові і одномоментно засікти час. Витягуючи гачком вміст краплі з інтервалом 20—30 с (гачок треба тримати вертикально), почекати, доки за гачком потягнеться прозора тонка нитка фібрину. 3нову засікти час і вважати цей момент початком зсідання. Потім, також зануривши гачок у краплю крові, потягувати вміст краплі горизонтально по склу з тим же інтервалом. Як тільки за гачком потягнеться згусток, засікти час, що відповідає закінченню процесу зсідання.

Результати робдти:

Початок зсідання крові через ____________хв.

Закінчення зсідання крові – утворення згустку через _________хв.

Висновки:

Загальний час зсідання крові становить____________хв., це свідчить про_______