Визначення активності ферментів.

П ро кількість ферментів судять за швидкістю реакції, що вони каналізують за певних умов.

Швидкість ферментативної реакції визначається кількістю речовин, які прореагували за одиницю часу при заданих умовах. Активність ферменту може бути виражена в різних одиницях. Часто активність визначають за кількістю субстрату, який прореагував за одиницю часу, або за кількістю продуктів, що утворились за цей час.

За одиницю будь-якого ферменту (що позначають на рос. і нім. Е, а на англ., франц., італ. і ісп. U) приймають ту його кількість, яка за оптимальних умов каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хв. Ця величина (1 мкмоль/хв.) є також міжнародною одиницею активності ферменту.

У зв'язку з введенням Міжнародної системи одиниць (СІ) запропоновано нове вираження активності ферменту в каталах (кат, kat).

Катал - це одиниця ферментативної активності, що відповідає кількості каталізатора, здатного перетворити 1 моль субстрату у продукт за 1 с (моль/с).

Так, якщо активність ферменту становить 2 мккат, це значить, що у пробі міститься така кількість ферменту, яка може здійснити перетворення 2 мкмоль субстрату за 1 с.

Відношення міжнародної одиниці (U) до каталу можна виразити таким чином:

1 кат = 6 ^. 10⁷ U; 1 U = 16,67 нкат

Для вираження активності в практичній роботі з ферментами часто користуються довільними поняттями питомої і молярної активності.

Питому активність ферменту прийнято виражати числом одиниць ферментативної активності на 1 мг білка (або числом каталів на 1 кг активного білка).

Кількість молекул субстрату, що піддаються перетворенню однією молекулою ферменту в продукт в процесі реакції в одиницю часу (1 хв.) при повному насиченні ферменту субстратом, прийнято називати числом оборотів ферменту, або молярною активністю (молярна каталітична активність виражається в каталах на 1 г-моль ферменту).

Активність у каталах використовують для порівняння активності різних препаратів одного й того ж ферменту, а для порівняння активності різних ферментів використовують молекулярну активність.

В харчовій промисловості використовують свої одиниці активності, активність називають здатністю: амілолітична здатність (така кількість ферменту, яка каталізує розщеплення 1 г розчинного крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом за 1 год при 30⁰С), протеолітична активність (кількість ферменту, необхідна для утворення 1 мг амінного азоту з білка за 1 годину) тощо.

Властивості ферментів

Біологічні каталізатори мають властивості:

1. Всі ферменти представляють собою глобулярні білки (єдиним виключенням з цього положення є виявлення у молекули пре-рРНК ферментативної активності, що отримала назву рибозима, яка каталізує самосплайсінг);

2. Збільшують швидкість реакції, але самі в ній не витрачаються (зараз доведено, що деякі ферменти в кінці хімічної реакції піддаються модифікації і навіть розпаду, а не вивільняються у незмінному вигляді, як постулював Міхаеліс); звільнюючись, ферменти можуть знову реагувати з новими молекулами субстрату;

3. Їх присутність не впливає ні на природу, ні на властивості кінцевого продукту реакції;

4. Дуже мала кількість ферменту викликає перетворення великої кількості субстрату. Наприклад, одна молекула ферменту реніну, що міститься в слизовій оболонці шлунку теляти, створожує близько 10⁶ молекул казеїногену молока за 10 хвилин при 37⁰С;

5. Специфічність. Ця властивість різко відрізняє їх від неорганічних каталізаторів. Так, платина та паладій можуть каталізувати відновлення десятків тисяч сполук. Ферменти ж мають дуже високу специфічність. В залежності від механізму дії розрізняють ферменти з абсолютною, груповою та стереохімічною специфічністю.

Абсолютна - характерна для ферментів, які каталізують лише одну реакцію і діють на один точно визначений субстрат. Наприклад, уреаза діє лише на сечовину і не діє на похідні сечовини, напр. метилсечовину; аргіназа, розщепляє аргінін.

Абсолютно групова специфічність – здатність ферментів діяти на певний тип хімічного звязку, утворений певними радікалами (атомними групами). Так, пепсин гідролітично розщеплює пептидний звязок, утворений аміногрупами тирозину та фенілаланіну; карбоксипептидаза відщеплює в пептидах з С-кінця майже всі амінокислоти; мальтаза гідролізує всі субстрати, до складу яких входить –глікозидний звязок.

Відносно групова специфічність (специфічність за типом звязку) – здатність ферменту діяти на певний тип хімічного звязку, утворений радікалами будь-якої хімічної будови. До таких ферментів належать ліпази та естерази, що розщеплюють не тільки різні триацилгліцериди, а й ді- та моноацилгліцериди та інші складні ефіри.

Оптична або стереохімічна специфічність – здатність ферменту діяти лише на одину стереоізомерну форму субстрату. Так, -Д-глюкозооксидаза, діє лише на -Д-глюкозу; L-оксидаза перетворює тільки L-амінокислоти.

Тобто ферменти можуть розрізняти хімічні сполуки, що відрізняються між собою досить незначними деталями будови.

Е.Фішер в 1890 р. запропонував теорію, згідно якої для того, щоб відбулась ферментативна реакція, необхідно, щоб мала місце відповідність форми молекули ферменту формі молекули субстрату. Цю гіпотезу називають гіпотезою “ключа і замка”: субстрат порівнюється в ній з ключем, який повинен точно підходити по формі до “замку”, тобто до ферменту.