1.3 Закономерности биодеградации полимеров и их использование в тканевой инженерии
Важным фактором, определяющим возможность или сдерживающим клиническое применение биодеградируемых материалов, является проблема регулируемости и контролируемости процессов их биодеструкции в условиях организма. По сравнению с другими веществами полимерные материалы гораздо быстрее изменяют свои свойства, утрачивая прочность и эластичность, вплоть до самопроизвольного разрушения изделия даже в отсутствие внешних сил. Причиной такого поведения является деструкция составляющих их полимеров.
Повышение скорости биоразложения материалов возможно несколькими способами: синтез новых полимерных структур, введение в макромолекулы фрагментов, разлагающихся под действием внешних факторов, использование смесей полимеров с разной скоростью биодеградации. Наиболее важными характеристиками полимеров, которые влияют на их способность разлагаться и усваиваться микроорганизмами, являются химическая природа полимера, разветвленность макроцепи, молекулярная масса и надмолекулярная структура [40].
Классифицировать процессы деструкции полимеров (т.е. разрыва химических связей основной цепи макромолекул) можно по двум признакам: по механизму разрушения цепи и по типу энергии, вызывающей деструкцию. По механизму разрушения цепи выделяют цепные процессы (деполимеризацию), при которых от активного конца макромолекулы, возникающего за счет энергетических факторов, последовательно отщепляются молекулы мономеров. Другой механизм разрушения цепи осуществляется по закону случая, когда под действием энергетических факторов рвутся химические связи, наиболее напряженные в силу флуктуационных причин [41]. Не исключено, что деструкция может протекать и по смешанному механизму.
Практически все виды энергии способны вызывать деструкцию полимеров. Различают деструкцию термическую, радиационно-химическую, фотохимическую, химическую (гидролиз, аммонолиз, окисление), механохимическую и др. Чаще всего деструкция протекает при одновременном действии ряда факторов, и не всегда можно выделить вклад каждого из них в отдельности. Биологическая деструкция является одним из основных видов деструкции полимеров. Это деструкция, протекающая при воздействии на полимерное вещество различных ферментов. В более широком смысле под биодеструкцией полимеров понимают деструкцию, протекающую под воздействием факторов окружающей среды (воды, почвы, биологических сред организма, света и тепла и др.). Многие синтетические полимеры, особенно карбоцепные, не подвержены биодеструкции и могут сохраняться в окружающей среде многие годы. В отличие от них, биополимеры претерпевают биологическую деструкцию, превращаясь в низкомолекулярные соединения.
Скорость процесса деструкции является важной характеристикой. Но оценить истинное значение константы скорости такой химической реакции удается крайне редко и только в строго определенных (лабораторных) условиях. В реальных условиях из-за большого числа факторов, влияющих на деструкцию, чаще всего используют косвенные методы оценки скорости прохождения процесса в целом.
Для оценки скорости деструкции можно выделить несколько наиболее широко используемых методов [41]:
1.Определение изменения массы и линейных размеров образцов. При оценке степени и скорости деструкции этим методом определяется убыль массы за единицу времени. Если известна площадь поверхности, то из этих данных можно подсчитать убыль массы с единицы площади за единицу времени и оценить соответствующие константы скорости. Аналогичным образом определяют и размерные характеристики образцов.
2. Определение изменения средней молекулярной массы и молекулярно-массового распределения полимера. В этом случае определяются молекулярные характеристики исходного образца, а затем через определенные промежутки времени – образца, подвергающегося деструкции. Неоднородность деструкции по объему образца затрудняет интерпретацию результатов.
3. Определение изменения концентрации продуктов деструкции. Используя такой подход, определяются самые разные характеристики (суммарный объем газообразных соединений, концентрация выделившегося мономера или продуктов деструкции конкретного полимерного материала, изменение pH). Как правило, этот метод дает надежные результаты при полной деструкции исследуемого образца.
4. Определение изменения концентрации введенных в образец низкомолекулярных продуктов. Наиболее важными “метками” в таких случаях являются красители и вещества, содержащие радиоактивные изотопы, во многих практических случаях используют лекарственные вещества.
5. Определение скорости изменения механических характеристик деградируемых изделий. Как правило, эти исследования проводят для пленок или волокон.
6. Определение скорости изменения температурных характеристик полимера, из которого изготовлено исследуемое изделие (температур плавления и стеклования).
Все перечисленные методы не являются абсолютными, а их результаты сильно зависят от условий проведения эксперимента. Наиболее надежную информацию о скорости процесса дают методы определения потери массы образца, изменения молекулярной массы или концентрации продуктов деструкции образцов. По этим характеристикам можно оценить среднюю степень деструкции образца в целом. Однако в силу гетерогенной природы процесса следует учитывать соотношение поверхности и объема в каждом конкретном случае.
Особое место занимают исследования деструкции полимеров in vivo, однако эти исследования проводят уже при создании лекарственной формы.
Биодеградируемые синтетические биоматериалы на основе описанных выше полимеров органических гидроксикарбоновых кислот одними из первых стали использоваться для тканевой инженерии. Биодеградация этих полимеров происходит путем гидролиза до углекислого газа и воды, с некоторым повышением pH окружающих тканей [31]. Механическая прочность сохраняется максимум до 21 – 29 дня, с потерей массы до 40% к этому периоду. Материал не обладает цитотоксическими свойствами, обеспечивает адгезию и поддерживает пролиферацию клеток, а также обладает в некоторой степени остеоиндуктивными свойствами. Наилучшими показателями обладают сополимеры PGA и PLA – PGLA, которые в зависимости от процентного соотношения молочной и гликолевой кислот могут менять свойства продукта, например, пластичность, прочность,рсрокрбиодеградации. В течение длительного времени производилось тестирования этих полимеров с различными типами клеток. Было установлено, что данные материалы могут служить матрицей для создания тканеинженерных конструкций мышечной, хрящевой, костной и эпителиальной ткани. Особое место полимеры на основе молочной и гликолевой кислот заняли в реконструктивной хирургии и регенеративной медицине. В настоящее время они используются в клинической практике, и были одобрены FDA (Агентством по контролю за лекарствами и продуктами питания США) как "первые" безопасные биоматериалы для тканевой инженерии [32].
На сегодняшний день, матрицы на основе PGA, PLA и PGLA легли в основу создания таких тканеинженерных органных конструкций как кожа, кость, хрящ, сухожилие, тонкая кишка и д.р и продолжают свое триумфальное шествие по просторам регенеративной медицины. Однако такие их недостатки, как повышение pH окружающих тканей при гидролизе и недостаточная механическая прочность, ограничивают и не позволяют их использовать как универсальный материал для матриц-подложек. Несмотря на некоторые минусы, эти материалы еще в течение длительного времени будут составлять значительную конкуренцию другимgполимерам.
Разложение ПКЛ идет в два этапа. На первом этапе постепенно идет снижение молекулярной массы полимера без деформации тканеинженерной конструкции. По мере уменьшения молекулярной массы ПКЛ начинает расщепляться на фрагменты, затем следует абсорбция и выведение. В естественных условиях деградация ПКЛ происходит гидролитическим процессом в течение 2—3 лет с образованием таких продуктов деградации, как вода, углекислый газ и капроновая кислота. Причем здесь можно выделить следующую зависимость: чем ниже молекулярный вес ПКЛ, тем короче сроки деградации.
Капроновая кислота — это жирная кислота с водной растворимостью 9,72 мг/мл, присутствующая в различных животных жирах и нефти. В норме содержится в биологических жидкостях человека (крови, спинномозговой жидкости, моче) в количестве 0—105, 0—1,5 мкмоль/л и 0,91—1,05 мкмоль/ммоль креатинина соответственно [43, 44]. Производные средних триглицеридов, к которым относится капроновая кислота, широко используют для послеоперационного питания, в пищевых продуктах, косметической и лекарственной индустрии. Это подтверждает, что продукты деградации поликапролактона практически не оказывают токсического воздействия на ткани организма.
Из других биодеградируемых полимеров отметим полипропилен фумарат – достаточно прочный, пластичный полимер, предназначенный для длительной поддержки механической прочности конструкции в течение минимум 200 дней. Биодеградация в данном полимере происходит ферментативным гидролизным путем, но в отличии от предыдущих материалов не влияет на pH окружающих тканей [45,46]. Моноангидриды (поли-[триметилимидодлицин-сп-bis(карбоксифенокси) гексан], поли[пиромеллитимидоаланин сп-1,6-bis(карбофенокси)-гексан]) - представители наиболее изучаемых в настоящее время полимеров. Они биологически резорбируемы поверхностной эрозией в течение 28 недель. Отличительной особенностью этих полимеров является высокая механическая прочность (до 60 MPa), что позволяет использовать их для реконструктивной хирургии кости и сухожилий.
Полиортоэфиры – полимеры, также относящиеся к биорезорбируемым материалам, с достаточно высокой прочностью. Резорбция осуществляется посредством поверхностной эрозии в течение 150 дней. Отличительной особенностью является более выраженные остеоиндуктивные свойства, что позволяет их использовать в реконструктивной ортопедии.
Таким образом, изучение механизмов регенерации тканей и органов, поиск новых технологий, которые могли бы восстановить утраченную функцию органа или системы, привели к появлению новых направлений, возникших на стыке биотехнологии и медицины – тканевой инженерии, регенеративной медицины и органогенеза. Эти науки изучают создание органов и тканей de novo. В их основе лежит принцип трансплантации клеток на матрицах-носителях. Основными критериями биологически совместимой матрицы для создания тканеинженерной конструкции должны быть: отсутствие цитотоксичности, поддержание адгезии, фиксации, пролиферации и дифференцировки помещенных на ее поверхность клеток, отсутствие воспалительной реакции на материал и иммунного ответа, достаточная механическая прочность в соответствии с назначением, биорезорбируемость обычными метаболическими путямип[47]. Немаловажное значение играет и физическая форма полимерной матрицы - пористая пленка, гель или суперпористый нановолокнистый материал. В целом ряде работ [48-51, 15] было изучено влияние условий получения материалов из биодеградируемых полимеров на структуру и свойства пленок, волокон и микрокапсул. Для придания изделиям из полимерных материалов необходимого комплекса эксплуатационных свойств, применяют различные виды химической, физической или физико-химической модификации на стадии подготовки сырья или в процессе формования изделия. С химическим модифицированием связаны методы получения и модификации свойств волокнистых и пленочных материалов медицинского назначения [51-54].
Так, например, материалы для временного замещения тканей организма должны обладать пористой структурой. Регулирование кинетики выделения биологически активных соединений возможно путем изменения условий формирования структуры полимерного материала. Регулировать надмолекулярную и пористую структуру полимерных материалов позволяет метод формования их из растворов [55, 56]. Изменить структуру волокна можно введением модифицирующих добавок в состав полимерного материала при формовании из совместного раствора или дисперсии в растворе полимера.
Методом, способным обеспечить создание материалов, пригодных для тканевой инженерии, является электроформование. На рисунке 1.8 показано изменение числа публикаций и темпов развития данного направления науки.
Рисунок 1.8- Количество ежегодных публикаций об использовании ЭФ в области тканевой инженерии [57]
Ряд исследований были направлены на исследование техники электроформования для сердечно-сосудистых приложений, учитывая механические и биологические характеристики клеток. Учитывая необходимые параметры, исходное волокно (материал) должно иметь конкретные механические свойства и, следовательно, необходимо проводить выбор материала, из которого будут получены необходимые в тканевой инженерии образцы с высокой вероятностью [58]. Для этой цели, использовали смесь ПЛГА с ПОА, и ПГА и ПКЛ были исследованы в одинаковых условиях при динамической нагрузке, имитируя физиологические свойства среды; в случае ПГА/ПОА смесей наблюдалось резкое снижение механических свойств [14]. Клеточный ответ на структуры ЭФ ПЛГА оценивали с помощью кардиомиоцитов, Это показывает очевидное улучшение свойств в смеси [15]. Многие исследования были проведены in vitro, анализируя свойства свежесформованных сосудов [47-49].