Сурет 7. Жасушаларды иммобилъдеу тәсілдері

Көбіне алғашқы екі тәсіл колданылады. Биологиялық жағынан оқшау затқа бекіген жасушалар өз өміршендігін сақтайды. Бекіген жасушалар төңірегінде қоректік орта көп мөлшерде жүріп тұрады, оның құрамын өзгертіп, өсу қарқындылығын бәсендетіп, қосымша заттарды көбірек алуға болады.

Өндірісте қолданылатын иммобильденген жасушаларды өсіру үшін биореактордың бағана тәріздесі қолайлы, өйткені мұнда орын үнемделеді және жасушалар арқылы ағып жаткан қоректік ортаны бақылау оңайланады. Кейбір өсімдіктер жасушалары метаболизм барысында жарықты қажет етеді.

Иммобильденген жасушалар түрлі заттардың биотрансформациясына да қолданылуы мүмкін. Иммобильденген жасушалар технологияда ұзақ уақыт пайдаланылатын болғандықтан, биокатализ процесі арзанға түседі.

Иммобильденген жасушалардың суспензияда өскен жасушалармен салыстырғанда мынадай артықшылықтары бар:

- биомассаны қайта-қайта ұзақ уақыт пайдалану (жасушалар биореактор ішінде сақтала береді, ал өнімдер қоректік ортадан бөлініп алынады);

- жасушалардың қозғалысы шектелгендіктен, олар қоректік ортаға бөлініп шықпайды, онымен араласпайды;

- жасушалардың мол биомассасын сыйымдылығы шамалы ыдыстарда өсіру;

- жасушаларды ұзақ өсіру;

- биотрансформация мүмкіншілігі.

6. Жеке клеткаларды өсіру екі этаптан тұрады: алдымен өсімдік ұлпаларынан, негізінде каллус ұлпасынан, зақымдалмаған тіршілікке икемді клеткаларын оқшаулап алады, одан кейін клеткалардың өсуіне және бөлінуіне қолайлы жағдайлар жасалады. Сұйық ортада өсетін клеткалар алудың үш әдісі бар: 1/ Сұйык қоректік ортаға борпылдақ дпфференцияланбаған каллусты ауыстыру ең колайлы әдістердің бірі, айналмалы шайкағышты сұйық ортада өсіргенде каллус оңай ыдырап кетеді. Ондай каллустарды қоректік ортадағы гормондардың арақатысын реттей отырып өсіріп алуға болады. Мысалы: ортада ауксиондер / жақсысы 2,4 -Д / мөлшері көп, ал цитокининдер және кальций аз мөлшерде / жоқ болса тіпті жақсы, болса қолайлы жағдай. 2/ Бастапқы экспланттарды, мысалы, тозаңқаптарды сұйық қоректік ортаға салып каллусогенез процессінің өзін сол ортада жүргізеді. 3/ қатты тығыз каллусты кесіп, бөлшектеп, біріккен клеткаларды ажыратқаннан кейін сұйық қоректік ортада өсетін клеткалардың көзі болу мүмкіндігі бар. Жеке клеткалардан және ұсак, агрегаттардан / біріккен клеткалар/ тұратын суспензияны алу үшін клеткаларды саңылаулары белгілі елек арқылы сүзіп алады, не болмаса суспензиядағы ірі агрегаттарды минут сайын тұндыру жолымен бөліп алады. Ортадағы жекеленген клеткалар мен ұсақ агрегаттардың мөлшерін көбейту үшін, суспензияның жеңіл фракцйяларынан алынатын инокулюмді жиі-жиі жаңа ортаға ауыстырып отыру керек. Инокулюм - жаңа қоректік ортаға отырғызу үшін пайдаланылатын суспензияның бір бөлігі. Клеткалардың диссоциациялану дәрежесіне қоректік ортаның құрамы, ауамен қанықтыру, суспензияның араластырылуы әсер етеді. Қанша күш салғанмен біркелкі жеке клеткалардан тұратын суспензияны алу мүмкін емес. Ең жақсы жағдай жасалғанның өзінде жеке клеткалар саны 60% аспайды, ал қалған бөлігі 2 ден 10 клеткаға дейінгі топтар және көп клеткалы агрегаттар үлесіне тиеді.

Өндірістік мақсаттар үшін, бірнеше қайталап отырғызып өсіру кезінде клеткалардың эпигенетикалық көрсеткіштерін өзгеріссіз бір деңгейде сақтайтын клеткалар бағалы. Болашақтағы клеткалық технологиялардың объектісі гомоплоидтық, өнімділігі бір қалыпты, бөлінуі синхронданған жеке клеткалар болуы керек.

Өсімдік клеткаларының қатты целлюлоза- пектин қабығы және үлкен вакуолі болғандықтан, қабығы сынғыш, механикалық өсерге өте сезімтал, сондықтан суспензияны ұқыптап араластыру керек.Араластыру және ауамен қанықтыру үшін айналмалы шайқағышты қолдану немесе зарарсызданған ауаны коректік ортаға үрлеу арқылы жүргізіледі.

Жүзгін клеткаларды үлкен көлемді сұйық коректік ортада өсіруге арналған аппараттарды ғалымдар жыл сайын жетілдіріп жатқанын айта кету керек. Егер алғашқы жұмыстар жүргізілген кезде клеткаларды сұйык қоректік ортада өсіру үшін қарапайым роллерлі /дөңгелегіш/ қондырғылар және қуаты аз шайкағыштар қолданылған болса, қазір көлемі үлкен микробиологиялық ферменттерлер қолданылуда. Клеткаларды сұйық қоректік ортада өсірудің бірнеше әдістері бар.

Клеткалардың бір бөлігін /инокулюмді/ жабық ыдыстарда көлемі бір қалыпты сұйық қоректік ортада өсіруді жиналмалы немесе мерзімді өсіру деп атайды. Бұл жағдайда клеткалар өсетін жүйе газдар мен клеткалық метаболизмде ортаға бөлінетін үшқыш заттардан басқаға жабық. Сұйык коректік ортадағы клеткалардың өсуі бәсеңдегенде, ортадағы клеткалар тығыздығы бастапқы деңгейге жеткенше жаңа дайындалған коректік орта қосылады да клеткаларды өсіру циклі кайталанады. Инокулюмді жаңа коректік ортаға отырғызғаннан бастап келесі қайталап жаңа коректік ортаға отырғызуға дейінгі уақыт аралығын клеткаларды өсіру циклі деп атайды, ал өсу циклі деп, қоректік ортадағы клеткалардың өсуінің стационарлық фазаға шығуына дейінгі мерзімді атайды. Клеткаларды қоректік ортаның ағынында өсіру - үзіліссіз өсіру деп аталады, оның үш түрі болады: 1/ ағынды жабык, жүйеде өсіру- клеткалар үздіксіз жаңа қоректік ортамен қамтамасыз етіліп тұрады, клеткаларға түсетін орта көлемі мен пайдаланылған ортаның ағып шыққан көлемі бірдей болады, ал клеткалар сол ортада кала береді; 2/ ағынды-ағынсыз жүйеде өсіру- сұйық қоректік ортада өскен клеткалар суспензиясының бір бөлігі әлсін-әлсін алынып тұрады, қалғанына нақ сондай мөлшерде жаңа қоректік орта құйылады; 3/ ағынды ашық жүйеде өсіру- үздіксіз ағып түсіп жатқан жаңа коректік орта мен сол ыдыстан алынған өскен клеткалар суспензиясы көлемдерінің тең болуы.

Бұдан баска клеткаларды үзіліссіз өсіру үшін турбидостат және хемостат әдістерін қолдануға болады. Турбидостат ережесімен үздіксіз, тыстан ешқандай шектеусіз өсіру аркылы клеткалар популяциясының өсу карқындылығы белгілі бір деңгейде ұсталады, өсу оптикалық тығыздығын тексеру арқылы бақылайды. Бұл әдісті клеткаларды өсірудің бастапқы кезеңінде қолданады. Клеткалар суспензиясын хемостат әдісімен өсіргенде, клеткалар популяциясының өсуі мен тығыздығы құрамында өсуді тежейтін факторы бар қоректік орта арқылы реттеледі. Хемостат принципі клеткалардың өсуінің экспоненциялдық фазасының соңғы кезеңінде қолданылады.

Р.Г.Бутенко, өсімдіктердің экономикалык жағынан тиімді және құнды заттар алу үшін, клеткалық технологияларды жан-жақты зерттеп, олардың алдағы уақыттағы мүмкіндігін, болашақта қол жеткізуге болатын табыстарын төмендегідей деп тұжырымдайды:

Қазіргі технологиялар:		Келешектегі технологиялар:
Жабайы типті клеткалардың штамдары		Мутант және қолдан кұрастырылған клеткалардың штаммдары
Клеткаларды жиналмалы (мерзімді) өсіру		Клеткаларды ортанын үзілмейтін ағынында өсіру
Оттегі бірқалыпты		Оттегі мөлшерін көбейту.
Клеткаларды сұйық ортада өсіру (суспензия)		Иммобильденген клеткаларды өсіру.
Әдеттегі бақылау.		Процесстерді компьютерарқылы бақылау және басқару.

4. Қосымша заттарды алу үшін жасушалық технологияларды дайындау жұмыстарының 7 кезеңі бар, олар;

1. Экономикалык жағынан тиімді өсімдікті таңдап алу жасанды қоректік ортада өсіру үшін таңдап алынған өсімдіктердің құрамында айтарлықтай мөлшерде құнды, экономика жағынан тиімді қосымша заттар болу керек. Бұл келтірілген қағиданың әсіресе сирек немесе жойылып бара жатқан өсімдіктерге қатысы бар.

2. Ұлпаларды жасанды қоректік ортада өсіруге алғаш рет енгізу. Бұл максат үшін, құрамында ең көп мөлшерде ізделіп отырған заты бар жеке өсімдіктер таңдалынып алынады.

3. Алынған биомассаның сандық және сапалық құрамын химиялық әдістер арқылы зерттеу. Өсімдіктердің ретсіз өсіп көбейетін каллустық клеткалары косымша түзілетін қосылыстарды тек бір ерекше жағдайда болмаса, тұтас өсімдіктердің кор жинайтын мүшелеріне қарағанда кем ұстайды. Бұндай жағдай бүтін организмде қосымша түзілетін заттардың синтезі цитодифференцировканың бакылауында болатындығын көрсетеді.

4. Үйлесімді қоректік орта мен өсіру жағдайларын іріктеу. Бұл жұмыс іп vitroөскен клеткаларды сұйык ортаға ауыстырғанда бұрынғыдан да күрделене түседі, оның себебі сұйык, ортада аэрациялау және шайқап араластыру т.б. факторлардың әсерін ескеру керек.

5. Клеткалардың өнімді штаммдарын алу. Құрамыңда қосымша заттардың қандай болса да біреуі мол біркелкі клеткалар популяциясын шығару қиын және күрделі міндет. Себебі, жасушалар популяциясын ұзақ уақыт жасанды ортада өсіргенде, генетикалық өзгергіштікке ұшырайды, тіпті басында жалғыз жоғары өнімді жасушаны клондау арқылы алынған болса да біраз уақыттан кейін, жеке клеткалар құнды қосылыстар синтездеу кабілетін жоюы да мүмкін.

6. Ең жақсы өнімді штаммдарды сұйық қоректік ортада өсіру. Бастапқыда қатты қоректік ортада алынған каллустық клеткалар сұйық қоректік ортаға ауыстырылады. Клеткаларды өсіру тәсілінің өзгеруі, штаммдардың ерекше қасиеттерінің өзгеруіне әкелмеу керек, яғни штаммдар жасанды орталарда өсіру кезінде болатын стресстерге тұракты болуы керек.

7. Өнімді және тұрақты штаммдарды өндіріс жағдайында ферментерлардың көлемін біртіндеп үлкейте отырып өсіру. Егер, осындай жартылай өндіріс жағдайында өсірілетін клеткалар жоғары деңгейдегі өсу жылдамдығын дәне ізделіп отырған затты биосинтездеу қабілетін сақтап, оны жинақтап және қоршаған ортаға көп мөлшерде бөлетін болса, онда бұндай штамм ірі масштабта өндіріс ұйымдастыру үшін жарамды болады.

8. Клеткалық биомассаны алу және оны бағалаудың техникалық регламентін (іс тәртібін) жасау.

Қазіргі уақытта дүние жүзінің әр түрлі елдерінде экономика жағынан маңызды заттар өндіруге бағытталған биосинтездік өнеркәсібінде елуден астам өсімдіктер түрлерінің клеткалары қолдануда, олардың ішінде жень-шень, рауволъфия, оймак, гүл және дельта тәрізді диоскорея, торғайшөп, итжедек, алка, сасық мендуана, меруерттүл, агава, апиын т.б.