Тақырып 5. Іп vitro жағдайыңда өсірілетін клеткаларды биотехнологияда қолдану.
Жоспар:
1. Қажетті өнімдер биосинтезі. Биотрансформация.
2. Клондық көбейту мен сауықтыру. Өсімдіктерді генетикалық жақсарту.
3. Жаңа сорттарды шығарудың эволюциялық принциптері.
1. Қажетті өнімдер биосинтезі. Биотрансформация.
Каллус клеткалардың өсуі тұтас өсімдіктердің өсуі сияқты Ѕ-тәрізді қисық сызықпен бейнеленеді. Клеткалар саны немесе массасы өсіру мерзімінің функциясы ретінде графикте көрсетілсе, ол Ѕ-тәріздес қисық болып шығады (6-сурет). Бұл зандылық қатты және сұйық ортада өсетін клеткалар популяцияларына тән.
Ѕ -тәрізді қисық мына фазалардан тұрады: 1) лаг-фаза немесе латенттік фаза (бүркеулі, жасырын фазасы), бұл кезде көзге көрінерлік өсу байқалмайды, бірақ су мен қоректік заттарды сіңіру процесі және бөлінуге дайындық. белсенді өтіп жатады; 2) үдеу фазасы, бұл кезде клеткалар бөлініп, созылып өсе бастайды; 3) экспоненциялдық немесе логарифмдік фазасы, бұл кезде өсу жылдамдығы өте қарқынды, уақыт өткен сайын екі еселеніп үдейеді, графикте түзу сызық болады; 4) өсудің бәсендеу фазасы, өсу жылдамдығы төмендейді; 5) стационар немесе бір сарынды фазасы, өсу тұрақты жүреді; 6) клеткалардың біртіндеп жойылып, құру фазасы. Бірақ нақтылы әр жағдайда фазаларының ұзақтылығы жағынан
S-тәріздес қисықтан едәуір айырмашылығы болады. Бұл генотипке (өсімдіктің түрі), өсіру жағдайына және алғашқы клеткалар санына байланысты.
Клеткалардың бір фазадан екіншісіне өтуін ішкі және сыртқы факторлар бақылайды. Ішкі факторларға пролиферативтік қор,
6-сурот. Клеткалардың in vitro жағдайында өсу циклін график арқылы бейнелеу.
созылып өсу ұзақтығы және клетканың күйі жатады. Сыртқы факторлар: қоректік ортаның құрамы, рН, оттегінің мөлшері, температура, клеткалар тығыздығы т.б. Пролиферативтік кор деп бөлінетін клеткалар санының клеткалардың жалпы санына қатынасын атайды. Оны қатынасты процентпен көрсеткенде митоздық индекс деп атайды. Өсірген клеткалардың барлығы бөлінбейді, сондықтан пролиферативтік қор төмендейді. Оның себептері:
1) біржолата, қайтымсыз дифференциялану;
2) клеткалардың тыным кезеңіне өтуі (G0);
3) клеткалардың құруы.
Клеткалардың бөлініп өсуі мен құруы теңескен кезде олар стационар күйінде болады. Бұл кезде әр түрлі фазаларда болған клеткалар саны сол фазаның ұзақтығына тура пропорционал келеді.
Өсу процесін әр түрлі факторлармен реттеп, мына көрсеткіштер арқылы бақылауға болады: клеткалардың мөлшері, көлемі, массасы, саны, белок пен ДНҚ мөлшері. Әрбір көрсеткіш тәжірибенің мақсатына байланысты есептеледі. Мысалы, клеткалардың өсуін зерттеу үшін белок пен ДНҚ мөлшерін анықтау және клеткалардың санын есептеу қолайлы келеді.
Суспензиядағы жеке клеткалар мен олардың кішігірім топтары қоректік заттардың құрамына қатты ортада өскен клеткаларға қарағанда талғағыш келеді. Жеке клеткалар араластырылып тұрған сұйық ортада бөлінуге қажетті кейбір заттарды жоғалтады. Сондықтан сұйық қоректік орталардың құрамын органикалық заттармен байытады. Сонымен қатар, суспензияға басқа ойдағыдай бөлініп өскен клеткалардың қоректік ортасын алып қосады. Агарда өскен клеткалардың өсуін жақсарту үшін басқа жақсы өсетін каллусты қолданады, оны «бағушы каллус» деп атайды. Сол каллустың үстіне нашар өсетін каллусты салады. «Бағушы каллустың» өсуді қоздыратын заттары үстіңгі каллусқа өтіп, оның бөлінуін арттыра түседі.
Бір қалыпты бөлініп ретсіз өсіп жатқан каллуста қайта дифференциялану процесінің арқасында ұлпалар (гистогенез), мүшелер (органогенез), ұрық тәрізді құрылымдар (эмбриоидогенез немесе сомалық эмбриогенез) пайда болады. Алдымен каллус өсіп, белгілі бір деңгейге дейін өз массасын көбейтеді (критическая масса). Сонан соң ол морфогенезге бағытталады. Бірақ, каллустың тек қана бірлі-жарым клеткалары өзінің даму бағдарламасын өзгерте алады. Өйткені тек сол клеткалар детерминацияланады, яғни өздерінің даму жолын өзгертуге дайын болады. Дәл осы кезде сыртқы факторлардың, әсіресе индуктордың әсері, шешуші болып шығады. Индуктор ең әсерлі қоздырушы, онсыз морфогенез процестері басталмайды. Көбінесе индукторлық қызметті фитогормондар атқарады. Сөйтіп клетканың күйі мен индуктордың әсері дәлме-дәл сәйкес келген кезде морфогенез процестері басталады.
Сонымен клетка редифференцияланады, басқаша айтқанда ол қайтадан дифференцияланады. Бұл өте күрделі процесс, ішкі және сыртқы факторлардың әсерімен реттеледі, геномның информациясын іске асыру программасы өзгеруіне байланысты. Ретсіз өсіп жатқан каллуста ұйымдасқан құрылымдардың, яғни меристемалық аймақтардың пайда болуын реттейтін факторлар жөнінде әлі анық түсінік жоқтың қасы. Сол меристемалық аймақтардан сабақтар, тамырлар немесе эмбриоидтар түзіледі. Бұл процесте ең басты факторлар гормондар, әсіресе олардың бір-бірімен ара қатынасы. Алғашқы рет бұл заңдылықты Скуг пен Миллер 1957 жылы анықтады, кейін оны көптеген тәжірибелер растады.
7-сурет бойынша ауксин мен цитокининнің деңгейлері орташа келгенде темекі каллусында айтарлықтай өзгеріс байқалмайды, ол бөлініп өсе береді. Ауксин/цитокинин ара қатынасында ауксин мөлшері жоғары болғанда тамырлар пайда болады (ризогенез), ал төмендегенде бүршіктер пайда болады (геммогенез).
Сондай-ақ бір каллуста төтенше жағдайда әр түрлі морфогендік құрылымдар пайда болуы мүмкін. Бұл құбылысты каллустың әрбір бөлігінде ерекше гормондардың концентрациялық градиенті түзіліп, соның арқасында морфогенездің түрлі жолдары индукцияланады деп түсінуге болады. Сонымен каллуста пайда болатын меристемалық аймақтардың түрі ауксин мен цитокининнің ара қатынасына байланысты болса да, олардың морфогенездің кезеңдерінде нақтылы қатысуы әзірше анықталмай отыр.
Алайда, толып жатқан өсімдіктердің каллустарынан гормондар балансын өзгертіп бүршік немесе тамыр шығаруға болмайды.
7-сурет. In vitro жағдайында темекінің өзекті паренхимасынан пайда болған каллус ұлпасында өтетін морфогенез процестері.
Бүршік пен тамырдың пайда болуын реттегенде фитогормондар әрекеттестігіне басқа факторлар да әсер етуі мүмкін. Мысалы, қант пен фосфаттардың мөлшері, азоттың көзі, пуриндер, т.б.Өткізгіш ұлпалардың (флоэма, ксилема) пайда болуына гормондар мен қатар қант та әсер етеді. Каллусқа ауксин мен қант ерітіндісін инъекциялағанда, онда өткізгіш элементтер пайда болады, бірақ олардың түрі ауксин мен қанттың концентрациясына байланысты. Сахарозаның концентрациясы 2 % болғанда көбінесе ксилема түзіледі, ал жоғары концентрациясын (8 %) қолданғанда флоэма түзіледі. Сахароза орнына глюкоза пайдаланылғанда гистогенез процесі жүрмейді.
Скуг пен Миллердің темекі каллусында ашқан заңдылығы in vitro жағдайында өтетін морфогенезді зерттеуге зор үлес қосты. Бірақ клетка мен молекула деңгейінде оның механизмі әлі белгісіз.
Сөйтіп, фитогормондардың морфогенезді қоздыратын мехамизмдері жөнінде мағлұматтар жоқ. Сондықтан өсімдіктердің әрбір түрін, тіпті сортын in vitro жағдайында өсіре бастағанда, оларға гормондар түрін, мөлшерін және ара қатынасын жаңадан іріктеп алу қажет.
мен қабығының компоненттері түзіледі. Созылу кезеңінен кейін клетка дифференциялануға көшеді, яғни оның мамандануы басталады. 5-ші суретте көрсетілгендей, клеткалар дифферен-циялануға циклдің G1 , G2 сатыларынан тыныштық кезеңдерінен (R1 R2,) өткеннен кейін ғана шығады. Дифференцияланған клеткалар бөлінуіне бет алғанда, яғни дедифференцияланғанда, клеткалық цикліне осы G1 G2 сатылары арқылы өтеді.
Сөйтіп, әрбір жас клетканың алдында үш жол ашылады. I) Клетка эмбриональды түрінде қалып, қайтадан клеткалық цикліне түседі. 2) Бөлінбей тыныштық күйінде циклден тыс қалады (G0 ). 3) Компетенцияға иеленіп біртіндеп детерминация салдарынан дифференцияланады, яғни маманданады.
Астық тұқымдасы және кейбір бұршақ тұқымдасы өсімдіктердің клеткалары мен протопласттарын өсіргенде морфогенезді қоздыратын және регенерацияға жеткізетін гормондар концентрациялары әлі анықталмаған. Осындай фактілер және толып жаткан әдебиет деректері морфогенездің гормондық теориясына күмән тудырады. Мурасигеннің айтуынша, Скуг пен Миллердің концепциясы органогенез процесіне тым жеңіл-желпі тусінік береді. Даму процесі өте күрделі процесс, ол бірнеше кезеңдерден тұрады, әр қайсысында гормондарға, жарыққа, температураға ерекше талап қойылады. Сонымен қатар, Мурасиге пікірінше, өсімдіктер өздері бөліп шығаратын заттардың әсерін еске алу керек. Бұл заттар улы болып, морфогенезді тежеуі мүмкін.
Қорыта айтқанда, in vitro жағдайында дифференциялану мен морфогенезді гормондармен реттеу концепциясын әмбебап концепция деп есептеуге болмайды. Себебі: 1) дифференциялану мен морфогенезді реттегенде гормондардың ерекшелігі жоқ (ауксин мен цитокинин каллус клеткаларының бөлінуін де, дифференцияланған клеткалардың да бөлінуін реттейді); 2) гормондық өндеуді сезінбейтін клеткалар бар (олар бөлінеді, бірақ, тотипотенттік қасиет көрсетпейді); 3) in vitro жағдайында есірген клеткалардың тотипотенттігі тек гормондарға ғана байланысты емес. Клеткалардың морфогенезге қабілеті өсімдікің генотипіне, оның физиологиялық күйіне, эксплант алынған мүшесіне, даму мерзіміне және басқа химия-физикалық факторларға байланысты.
Морфогенезге қабілет көрсетуде генотиптің ықпалы талай өсімдіктерде байқалған, мысалы, темекі, сәбіз, түсті қырыққабат, бегония, жень-шень, астық тұқымдастар. Эксплант алынған мүшенің де маңызы зор, кейбір түрлерде генеративті ұлпалардың морфогенді потенциалы вегетативті ұлпаларға қарағанда едәуір жоғары. Тіпті бір мүшенің әр түрлі ұлпаларында морфогенезге қабілеті бірдей болмайды. Мысалы, сәбіз флоэмасынан шыққан каллуста тамырлар пайда болса, ксилемасынан шыққан каллуста эмбриоидтар түзілген.
Бұл деректер in vitro жағдайында өтетін органогенезде клеткалардың алғашқы дифференциялануының маңызын көрсетеді. Тіпті бастапқы алынған эксплант ұлпаларының алғашқы дифференциялану процесі, соның кейбір механизмдеріне әсер етеді екен. Өсірген кезде ұлпалардың ерекшеліктері кейде ұзақ сақталады. Мысалы, қант қызылшасының тамыржемісінің ұлпасын өсіргенде, алғашқы клеткаларға тән белоктары ұзақ сақталған.
Өсірген клеткалардың цитогенетикалық тұрақтылығы мен морфогенезге қабілеті арасында өзара қатыстығы бар. Сәбіздің эмбриогенді каллусында, яғни эмбриоид түзетін каллуста клеткалар диплоидты болған. Ш. Тивари мен Қ. Исқақова арпаның тозаңқаптарын in vitro жағдайында ұзақ өсіріп, олардың морфогенезін зерттеп, цитогенетикалық жағдайы мен морфогендік потенциалының өзара байланысы болғандығын көрсетгі. Өсірген клеткалардың хромосомаларының саны гаплоидтық және диплоидтық болғанда ғана олардың регенерацияға қабілеті жоғары болған.
6 Дәріс