Сурет6. Іп vitro өсірілетін өсімдік жасушаларын пайдаланып манызды өнімдерді алу жолдары
Қоректік ортаның құрамы және басқа өсіру жағдайлары өзгеруі арқасында синтезделетін өнімдердін мөлшері тұрмақ сапасы да өзгереді. Соның нәтижесінде мүлде жаңа негізінде басқаша әсер ететін қосылыстар пайда болуы мүмкін. Мысалы, жапон ғалымдары іn vitroжағдайында ерекше пептидтарды, ісікке қарсы ем болатын қосылыстарды, убихинон -10 сияқты жаңа биологиялық активті заттарды алуда мол табысқа жеткен. Келешекте жасушалық биотехнология иммобильденген өсімдік жасушаларын пайдаланатын болады.
Өнеркәсіпте өсіруге жарайтын жасушалар жабайы мен екпе дәрілік және техникалық өсімдіктердің микробиологиялық өндірістің және химиялық синтездің бәсекесінен озып шығуы қажет.
Дағдылы өсімдікгер шикі затымен салыстырғанда өсірілетінжасушалардын мынадай артықшылықтары болады:
1) қоршаған ортаның әр түрлі факторларының (климат, маусым, ауа райы, топырак жағдайы, зиянкестер) ықпалынан тәуелсіздік;
2) өсіру жағдайларын өте жақсы деңгейде үзбей қамтамасыз ету арқасында өнімнің мөлшері мен сапасы жоғары;
3) егіс көлемі үнемделеді.
Өсімдіктер көптеген маңызды заттардың бірден-бір кайнар көзі болып келеді. Бірақ өсімдік шикізатының қоры табиғатта таусылып бара жатыр. Осыны еске алғанда, клеткалық технологиялардың орны болашақта ерекше зор екенін түсінуге болады.
2. Бастапқы өсімдіктің, яғни эксплант алынатын донор өсімдіктің генотипі өсірген жасушалардың биосинтездік потенциалына елеулі ықпал етеді. М.Ценк қызметтестерімен қызғылт қабыршөптің жасушаларын өсіру үшін бірнеше географиялық аймақтан 184 тұқым үлгісін жинап алған. Осы тұқымдардан шыққкан өскіндер арасынан серпентин мен аймалинин деген гипотензивтік индолдық алкалоидтарға өте бай (құрғак массасына 0,7 %) бірнеше өскіндер таңдап алынды. Солардан шыққан каллустар қажетті алкалоидтарды басқа өскіндерден алынған каллустарға қарағанда 4-5 есе артық синтездеген.
Өсіруге алынған экспланттың тегіне де назар аударылады. Мысалы, диоскореяның түйінінен алынған жасушаларын өсіргенде, оларда диосгениннің мөлшері өркеннен алынған жасушалармен салыстырғанда он есе артық болған. Алайда, көбінесе, жасушалар өсірген кезде қосымша заттарды синтездеуге тотипотентті келеді, яғни көрінген клетка лайықты жағдай жасалса өзі бөлініп алынған өсімдікке тән заттарды синтездей алады. Себебі қосымша метаболиттердің синтезін реттейтін гендер әдетте оларды синтездемейтін жасушаларында да бар. Кей кезде жасушалардың биосинтездік қабілеті регенерант өсімдіктерде бұрынғы қалыпына келеді. Мысалы, оймақгүлдің жасушалары ұзақ мерзім өсіргенде гликозидтерді синтездеу қабілетін жоғалтқан, ал регенерант өсімдіктерінде биосинтезі бұрынғы қальшына түскен. Сөйтіп, жасанды қоректік ортада өсірілген жасушаларда генетикалық ақпарат сақталады, бірақ онын жүзеге асуы үшін ерекшк жағдайлар қажет. Шамамен, жоғары өнімді өсімдіктер мен ұлпалардан бөлініп алынған жасушаларда сол метаболиттердің биосинтезіне қажет генетикалық ақпараты болады.
Өсірген жасушалардың қосымша метаболизмінде бүтін өсімдікпен салыстырғанда едәуір өзгерістер пайда болуы мүмкін. Ретсіз бөлініп, өсіп жаткан каллус жасушаларында қажетті заттың мөлшері шамалы болады. Тек кейбір ғана каллустар (мендуананың біраз түрлері) алкалоидтарды жоғары мөлшерде синтездейді. Сондай-ақ жень-шень жасушаларында белсенді заттардың мөлшері бүтін өсімдіктегіден кем болмайды.
Кейбір өсімдіктердің өсірген жасушаларында бүтін өсімдікте кездеспейтін заттар анықталған, мысалы, рутада заулииин мен рутакультин, стефанияда ароморин. Тегеурінгүлдің өсірген жасушаларында стериндер кұрамындағы компоненттердін саны бүтін өсімдіктен артық болған. Диоскореяның тамырсабақ жасушаларында In vitroжағдайында стероид сапониндер мен стериндер құрамының алғашқы ұлпадан әжептәуір айырмашылығы болған.
Өсімдік жасушаларындағы қосымша метоболиттерінің даму процестерімен, яғни дифференцияланумен тығыз байланысты. Каллустағы қосымша метаболизмнің өзгеруі, сірә онда дифференциация өтпегендіктен шығар. Дифференцияланған жасушалар көбінесе қосымша заттарды каллус жасушаларына қарағанда көбірек синтездейді. Бірақ бұл мүлдем бірыңғай зандылық емес. Соңғы көп деректер бойынша, жасушалардағы қосымша заттардың биосинтезіне оларда органогенездің өтуі қажет емес. Мысалы, кейде органогенез өткенде қосымша заттардың мөлшері тіпті төмендеп кеткен. Жасушалар автотрофтық қоректенуден гетеротрофтық қоректенуге көшу салдарынан өзінің генетикалық мүмкіншіліктерін толық жүзеге асыра алмайды.
Бірқатар өсімдіктердің каллустары өздеріне тән биосинтездерге қабілетін көп жылдар бойынша сақтай алады.
Өсімдік жасушалары In vitroжағдайында генетикалық жағынан әр текті болады және соның себебінен олардың қосымша метаболизмі өзгеруі мүмкін. Сонымен қатар, жасушалардың популяцияда әртектілігінің жағымды маңызы да бар. Олардың арасында қасиеттері күрт өзгерген, яғни мутант клеткалар кездеседі. Сондай-ақ, қажетті затты артық синтездейтін немесе тіпті жаңа заттарды шығаратын жасушалар болады.
3. Қоректік ортадағы фитогормондар - клеткаларда негізгі және қосымша заттардың алмасуын нәтижелі реттейтін маңызды фактор. Фитогормондардың ыкпалын зерттеуге арналған көп зерттеулер көрсеткендей, гормондардың әсері өсімдік түріне, қосымша заттың химиялық құрамына, жасушалар штамына т.с.с. байланысты.
Кең қолданылатын ауксин - 2,4-Д. Ол жасушалардың бөлінуіне де, созылып өсуіне де себепші бола алады. Бірақ ол қосымша метаболизмнің өнімдерінін синтезін шұғыл басып тастауы мүмкін. Ауксин мен цитокининнің типі мен концентрациясын өзгерте отырып, әрбір нақтылы жасушаларда қажетті заттың синтезіне жақсы ыкпал етуге болады.
Көмірсулар - биомассаныңн көбеюіне әсер ететін қоректік ортаның маңызды факгорының бірі. Жасушалар In vitroжағдайында гетеротрофты болғандықтан, көміртегі көзі ретінде сахароза пайдаланылады. Сахароза мен бірге кейде глюкоза да пайдаланылады. Сахарозаның көтерінкі концентрациясы қосымша заттардың артык шығуына ықпал етеді. Сонымен бірге сахарозаның жоғары концентрациясы қоректік ортаның осмос потенциалын арттырады. Сахарозаның ортаға көп қосылуы әлбетте өндірісті қымбаттатады, сондықтан арзан көмірсулар іздеп табу биотехнологияның өзекті міндетінің бірі.
Қосымша заттардың синтезіне коректік ортаның минералдық құрамы үлкен ықпал етеді. Олардың арасында ең маңыздылары азот, фосфор және калий. Бірақ олардың әсерінің өсімдік түріне және өнімге байланысты ерекшеліктері бар. Мысалы, бір жасушаларда азоттың органикалық формалары (пептон, ашыткы экстракты, казеин гидролизаты) қосымша заттардың қорлануын тежейтін болса, басқаларында керісінше синтезін арттырады.
Аммоний және нитраттық азоттың ара қатысы да әсер етеді. Мысалы, диоскорея жасушаларын өсіргенде ортада нитраттық азоттың мөлшерін көбейткенде, диосгениннін синтезі арта түскен. Темекіжасушаларын өсірген ортада сахароза, нитрат жәнс фосфордың мөлшерін азайтқанда, оларда никотин синтезі арта түскен. Адыраспан клеткаларын фосфоры жоқ ортада өсіргенде, оларда алкалоидтардың және басқа қосымша заттардың мөлшері өскен. Фосфордың жетіспеушілігі кейбір баска жасушаларда да қосымша заттардың синтезін арттыра түскен.
Қажетті өнімдердің кейбір алғы заттары олардын биосинтезіне дұрыс әсер етеді. Мысалы, шамалы коректік ортада ұзақ өсірген жасушаларға қажетті заттың алғы қосылыстарын бергенде, олар керек өнімнің синтезін жақсартады. Алғы заттар ретінде амин қышкылдары (глутамат, фенилаланин, лейцин, орнитин т.б.) мен органикалық қышқылдары (ацетат, сукцинат, шикимат т.б.) алынады. Соңында олардан әр түрлі күрделі заттар түзіледі.
Бірақ каллус ұлпалары оларды пайдаланбауы да кездеседі. Алғы заттар тіпті теріс әсер етіп, жасушалардың өсуін тежеп тастауы да мүмкін. Алғы заттардың маңызын анықтау үшін таңбалы қосылыстарды (изотоптарды) пайдаланып ұқыпты зерттеулерді өткізу керек.
Казеин гидролизаты, кокос жанғағының сүті сияқты құрамы белгісіз органикалық үстемелер ортаға буферлық әсер көрсетеді. Қоректік орталардың буферлік сыйымдылығы өте төмен, сондықтан олардың алғашқы рН көрсеткіші (5-6) жасушаларды өсіргенде тез-ақ бірнеше бірлікке жылжып кетеді. Соның арқасында жасушалардың биосинтездік қабілеттері мен өнімдердің жиналуы өзгереді. Қажетті өнімді мол шығарудың маңызды жолы - үйлесімді қоректік ортаны іріктеп алу. Қосымша заттардың қорлануына әсер ететін физикалық факторларға жарық, температура, газдың құрамы, араластыру тәртібі және ауамен қамтамасыздандыру жатады. Өсірген жасушаларда каротиндер, эфир майлары, флавоноидтар, пластохинондар, антоциандар, катехиндер, алкалоидтар, витаминдердін түзілуіне жарық дұрыс әсер еткен. Жарық фенолдар метаболизмнің ферменттерін активтеген, ал көмірсулар мен липидтардың алмасуына ол ықпал етпеген. Қосымша метаболизмге жарықтын сапасы, яғни спектрлік құрамы да әсер етеді.
Бүтін өсімдіктерде температура косымша метаболизмге әжептәуір әсер етеді, сондықтан жасушалар деңгейінде де мүндай зерттеулер жүргізу кажет. Клеткалардың өсуі мен синтездеріне кажет температура бірдей бола бермейді. Мысалы, адыраспан клеткалары 30°С жаксы өскен, ал олардын қүрамында алкалоидтар 25°С ең жаксы жинакталған.
4. Жасушаларды in vitro жағдайында өсірген кезде олардың өсуі мен биосинтездеріне өсіретін жүйелердің техникалық көрсеткіштерінің манызы өте зор. Өсімдіктердің қосымша заттарының биотехнология өндірісі көбінесе сұйық ортада өсетін жасушаларға негізделген. Зертхана жағдайында қосымша метаболизмді зерттеген кезде жасушалар әдеттегідей колбаларда кішігірім көлемде (40-200 мл) өсіріледі және айналмалы тербеушілерде араластырылады. Колбалардың айналу жылдамдығы (әдетінше минутына 90-120 айналым) жасушалардың өсуіне және метаболиттердің жинақталуына әсер етеді. Көлемі шағын колбалардан көп литрлік ферментерлерге ауысқанда өсіру көрсеткіштері өзгереді, әсіресе араластыру мен аэрациясы. Жасушалар суспензиясын өндірісте өсіру үшін микроорганизмдерге қолданылатын аппараттарды пайдаланады. Бірақ соңғы зерттеулер көрсеткендей, өсімдік жасушалары өздерінің өзгешеліктеріне қарай ерекше аппараттарды қажет етеді.
Өсімдік жасушаларының көлемі бактериялар мен саңырауқұлактарға қарағанда 10 есе, тіпті 100 есе ірі келеді, мұнымен ұатар онтогенезде де олардың көлемі өзгереді. Бастапұы экспоненциялдық өсу фазасында олар майда және тығыз болса, стационарлық фазасында көлемі өсіп вакуолі пайда болады. Неғұрлым жасушаның көлемі үлкейсе, соғұрлым оның араластыру арқасында бүлінуінің кауіптілігі арта түседі. Сонымен қатар, өсімдік клеткалары ірі және ауыр болған соң оларды жақсы араластырып тұру қажет. Өйтпесе олар ферментердің түбіне түсіп, тез қартаяды да ақырында жойылады.Жень-шень жасушаларын турбиналық араластырғыштары болған ферментерде өсіргенде айналу жылдамдығы минутына 100-350 айналымнан асқанда, оның теріс әсері салдарынан жасушаларда антрахинондардың синтезі төмендеген.
Штамның механикалық стресіне төзімділігі жасушаларды өсіргендегі маңызды талап. Суспензияны жұмсақ араластырып ауамен қамтамасыз етуге пневматикалық әдісі қолайлы, яғни ферментерге ауаның қысым күшімен жоғары көтерілген ағыспен келген стерильді ауаны үрлету. Бірақ бұл әдістің де кемшілігі бар, себебі суспензияда ауа артықк мөлшерде болуы себебінен жасушалар оттегінің кемшілігіне тап болады. Ал жасушалардың өсуі де, қосымша метаболизмі де оттегі мөлшерімен тығыз байланысты.
Өсімдік жасушалары сүйық ортада жақсы өсу үшін тығыздықгы талап етеді. Ол мынадай кедергіні туғызады: биомассаның өсуімен қоса суспензияның тұтқырлығы да өседі. Оның нәтижесінде адгезия (жабысу) пайда болады, жасушалар бір-біріне, ыдыстың кабырғаларына, былғауыш пен датчиктерге жабысып, өсіруге бөгет жасайды.
Ыдыстың жоғары жағында жасушалар бөліп шығарған белоктар мен полисахаридтерден тұратын көбік біртіндеп жинала бастайды. Өсе келе кейбір клеткалар өзара жабысып, осы көбікте жиналып «қабықты» немесе «безені» түзеді. Клеткалар биомассасы осе келе бұл қабық та қалыңдайды, ақырында араластыру қаркындылығы төмендеп, жасушалар құриды.
5. Агар қосылған қатты қоректік ортада өсірген жасушалар сұйық ортада өсірген жасушаларға қарағанда қосымша метаболиттерді көбірек синтездейді. Тәжірибелер көрсеткендей, борпылдақ қарқынды өсетін каллуска қарағанда тығыз баяу өсетін каллус жасушалары алкалоидтарды артық жинақтаған, яғни әдеттегі метаболизм жасушалардың кеңістікте әлдеқандай ұйымдасуын талап етеді.
Жасушның организмде жайғаскан орны онын дифференциялану типі мен дәрежесін белгілейтін факторлардын бірі. Бір-бірінен аулақтанып немесе кішігірім топта өсетін жасушалардың қоршаған ортасы ерекше болғандықтан метаболизм жолдары басқаша болады. Жасушалардың ұйымдасуы тұтас организмге неғұрлым жақын болса, соғұрлым олардын метаболизм жолдары да ұқсас болуы мүмкін. Өсірген жасушаларда қосымша метаболиттердің жинақталуы мен олардың дифференциялану дәрежесінде өзара байланысы бар екендігін ғылыми әдебиеттегі бірталай деректер дәлелдейді. Сондықтан, соңғы кезде иммобильденген клеткалар өздеріне назар аударуда. Табиғи немесе жасанды сактаушы заттардың беткі қабатына бекіген немесе полимерлік гельдер құрамына енгізілген, қозғалысы шектелген осы ортада өсетін жасушалар иммобильденген деп аталады. Жасушаларды иммобильдендіру (қозғалысын шектеу) олардың дифференциялануына жағдай туғызып, қкосымша заттарды көбірек синтездеуге жеткізеді. Иммобильденген клеткалар өзара тығыз байланыста өседі. Соның нәтижесінде олардың массасының ішінде тұтас организмдегідей, белгілі химиялық және физикалық градиенттер (бір бағытты өзгеру) пайда болады, ал олар метаболизм мен дифференциялануды реттейді. Жасушаларды мынадай төрт жолмен иммобильдеуге болады:
1) жасушаларды түрлі оқшау (инерттік) заттармен қаптау (альгинат, агар, полиакриламид, коллаген т.б.);
2) оқшау заттың беткі қабатына жасушаларды адсорбция арқылы орналастыру;
3) оқшау заттың беткі қабатына жасушаларды биологиялық макромолекулалармен (лектиндермен) «тігу»;
4) жасушаларды коваленттік байланыстар арқылы оқшау субстратқа орналастыру (мысалы карбоксиметилцеллюлозаға).
а - клеткаларды инерттік субстратка ендіру; б - клеткаларды инертгік субстратка адсорбция аркылы бекіту; в - клеткаларды инертгік субстратка биологиялык макромолекулалар көмегімен адсорбция аркылы бекіту ; г - клеткаларды ковалентті байланыстыру