Тақырып 9. Гаплоидтық технология

Мақсаты: Студенттерді тозаңқаптар мен тозаңдарды өсіріп гаплоидтарды алудың алғы шарттарымен, будан ұрықтағы хромосомалардың селективі жойылуы әдісімен гаплоидтарды алу әдістемесімен, гаплоидтык өсімдіктерді аналық гаметофитті өсіру арқылы алу әдісімен, гаплодтардың селекциядағы маңызымен таныстыру.

Жоспар

1. Гаплоидтарды дағдылы селекция әдістерімен шығару.

2. Микроспоралардын эмбриоидтарды түзіп немесе каллусты түзіп іп vitro жағдайында спорофиттік жолмен дамуы.

3. Каллус ұлпасынан эмбриоид түзілуі.

4. Өсімдік тозаңқаптары мен микроспораларында іn vitro өтетін морфогенез процестері мен өсімдік регенерациясы.

5. Гиногенезге түрлі факторлардын әсері.

Гаплоидтық организмнің сомалық клеткаларында сыңар хромосомалар жиынтығы (п) болады, яғни толық жиынтықтың (2п) тең жартысы. Гаплоидтарды дағдылы селекция әдістерімен шығару (түрішілік және түраралық тозаңдану, рентген сәулесін түсіру және басқа стресс факторлармен ықпал ету) оңай емес және көп уақытты талап етеді. Ал аталық және аналық гаметофиттерді іn vitro жағдайында өсіріп гаплоидтарды тез шығарып, селекция процесін женілдетуге болады. Бұл әдістер апомиксис процесіне негізделген. Апомиксис - организмдердің жыныссыз жолмен көбеюі.

Аталық гаметофитті (тозаңкаптар мен тозаң) іn vitroжағдайында өсіріп, гаплоидтық өсімдіктерді алу андрогенез деп аталады. Аналық гаметофитті (ұрық бүршіктер) өсіру арқылы гаплоидтық өсімдік алу гиногенез деп аталады. Сонымен қатар гаплоидтарды, аталық немесе аналық хромосомалары жойылып кететін будан ұрықты іn vitro жағдайында өсіріп алуға болады. Кейде гаплоидтық өсімдік псевдогамия арқасында пайда болады, яғни ұрықтанбаған жұмыртқа клеткасынан ұрық дамиды.

1. Бірінші рет сасықмендуананың тозаңқаптарын іn vitro жағдайында өсіріп, Индияда С. Гуха мен С. Махешвари 1964 жылы гаплоидтық өсімдіктерді алды. Содан кейін осы тәжірибені француз ғалымы К. Нич 1967 жылы темекінің тозанқаптарын өсіріп қайталады. Содан бері осы әдіспен гаплоидтар 200-ден астам өсімдік түрлерінен алынды, соның ішінде: бидай, арпа, қара бидай, күріш, картоп, рапс т.б. ауыл шаруашылық дақылдары.

In vitro жағдайында аталық гаметофиттен гаплоидтық спорофиттің шығуы өте күрделі, әлі егжей-тегжейі анықталмаған процесс. Микроспоралардан каллус немесе эмбриоидтар қалыптасып, кейін олардан гаплоидтық регенерант өсімдіктері шығады. Ол үшін микроспоралар іn vitro жағдайында дамудың өте күрделі процесінен өтеді. Ал бұл процестің түрткі болар себепкерлері мен реттеушілері әлі белгісіз.

Табиғи жағдайда іn vivoмикроспоралар (гаметофиттік) жолмен дамиды;

1) мейоздың нәтижесінде тозаңның бастапқы клеткасынан төрт (тетрада) микроспора пайда болады;

2) тетраданың қалың қабығынан микроспоралар босап шығады;

3) микроспора одан әрі даму жолында екі рет митоздан өтіп, соңында жетілген тозаң түйіріне айналады. Ал іn vitro жағдайында микроспора әдеттегі гаметофиттік даму жүйесінің кез келген фазасынан ауытқып кетіп, спорофиттік даму жолына түсуі мүмкін.

Микроспоралардың іn vitro жағдайында дамуы және гаплоидтық регенерант өсімдіктердің пайда болуы. Микроспоралардың іn vitro жағдайында дамуы бірнеше жолмен қамтамасыз етілуі мүмкін. Бірлі-жарымы гаметофиттік даму жолынан ауысып эмбриоидты түзеді. Басқалары дедифференцияланып, каллусқа айналады. Тағы біреуілері микроспорогенез бен гаметогенез жолын жалғастырады, яғни пісіп жетілген тозаңға айналады. Ал тағы бір тобы біртіндеп ыдырап құриды.

Б жолы – іn vitro жағдайында микроспора тепе-тең бірдей екі жасушаға бөлінуі мүмкін. Ал іn vivo дағдылы жолмен бөлінгенде пайда болатын екі жасушаның бірі генеративтік, бірі вегетативтік жасушалар. Ол екеуінің көлемі жағынан айырмашылығы бар. Бұндай гаметофиттік жолдан спорофиттік жолына ауысу Datura innoxia, Nicotiana tabacum түрлеріне тән.

А жолы - микроспора көлемі бірдей емес екі жасушаға бөлініп, вегетативтік және генеративтік жасушаларды түзеді. Бұл табиғи жолға ұқсас. Генеративтік клетка бірінші митоздан кейін кері кетеді. Вегетативтік жасуша көп бөлініп одан әрі зиготалық даму жолына түседі (А-В жолы). Бұндай даму жолы Nicotiana tabacum, Datura metel, Hordeum vulgfre, Triticum aestivum т.б. өсімдіктерде байқалған. Кей кезде тек қана генеративтік клетка бөліне бастайды (А-Г жолы), немесе екеуі де (вегетативтік пен генеративтік жасушалары) бірдей бөлініп, спорофитті түзеді (А-ГВ жолы). Микроспораның атап өткен бөліну бағыттары көпклеткалық гаплоидтық құрылымдардың (глобула, эмбриоид) пайда болуына себеп болады. Олардан гаплоидтық регенерант өсімдіктері шығады.

Егерде вегетативтік клетканың ядросы генеративтік жасушаның ядросымен қосылып кетсе (Д жолы), пайда болған диплоидтық жасушадан түзілген өсімдікте әрине диплоидтық болады. Сонымен қатар, диплоидтық өсімдіктер мейоз кезінде кейбір кемістіктері пайда болған микроспоралардан және эндополиплоидия өтуі салдарынан түзіледі.

Микроспоралардың даму бағытына әр түрлі факторлар әсер етеді.

1) микроспораларға тән табиғи полиморфизм;

2) микроспоралардың дамуындағы ауытқу;

3) микроспоралардың бөліну шүйкесінін орналасуы.

Микроспоралардың гаметофиттік даму жолынан спорофиттік жолына ауысуы генетикалық денгейінде анықталады, бірақ оның жүзеге асуы нақтылы физиологиялық жағдайлар мен түрлі индукциялау факторларға байланысты. Микроспораның даму бағыты ең алдымен оның даму кезенімен белгіленеді, және өсіретін қоректік ортаның гормондық құрамына байланысты болады.

Микроспорадан түзілген көпжасушалық құрылым дами келе эмбриоидқа айналса, одан шыққан регенерант өсімдік тікелей андрогенездің нәтижесінде пайда болады. Ал егерде көпжасушалық құрылым каллуска айналса, одан шыққан регенерант өсімдік жанама андрогенез нәтижесінде пайда болады.

Тозанқаптағы мыңдаған микроспоралардың ішінде тек қана кейбіреулері ғана эмбриоидты түзеді. Бұл құбылыс генетикалық деңгейде белгіленуі ықтимал. Эмбриогендік микроспоралардың саны түрлі стресс ықпалдарынан арта түседі. Мысалы, төмен және жоғары температура, ионизация туғызатын сәулелер. Тікелей андрогенез үшін донорлық өсімдіктін физиологиялық күйі, тозанның даму кезені, қоректік ортаның құрамы және өсіру жағдайларынын маңызы зор. Көптеген өсімдіктерде микроспоранын спорофиттік жолмен дамуы үшін бір ядролық кезеңі ең қолайлы болады. Каллустан шыққан өсімдіктердің бәрі гаплоидтық бола бермейді, сондықтан гаплоидтарды жаппай алу үшін ең жақсысы эмбриоидогенез арқылы өтетін тікелей андрогенез.

В. Ананд қызметтестерімен темекінің (Nісоtіаnа tаbасиm) тозаң қаптарын өсіргенде, эмбриоидтардың үш түрі пайда болғанын байқаған. Олар вегетативтік клетканың, генеративтік клетканың және ол екеуінің де бірге бөлінуінен түзілген. Осы эмбриоидтардан гаплоидтык өсімдіктер алып, оларды топыраққа көшіріп, гүлденуге дейін өсірген. Олардың жапырақтары мен гүлдерінің морфологиялық құрылысын зерттегенде, бұл өсімдіктер де бір-бірінен айырмашылықтары бар үш типке бөлінген.

Тозаңқаптар мен микроспораларды өсіргенде, каллустың екі типі пайда болатыны көрсетілген: біріншісі - әр түрлі гетерогендік клеткаларынан түрған, екіншісінін құрамында меристемалық клеткалар ошағы болған. Регенерация процесі екінші каллуста өте жеңіл өткен, себебі меристемалык аймақтардан (ошактардан) өркендер тез өсіп шыққан.

Гүл тозаңының іп vitro өсіру. Тозаңқаптарды іn vitroөсіргенде, каллус тек микроспоралардан ғана емес, олардың спорогендік ұлпаларының диплоидтық клеткаларынан да түзілуі мүмкін. Сондай каллустардан шыққан регенерант өсімдіктер диплоидтық немесе полиплоидтық болады. Тозаңқаптарды өсіргендегі тағы бір кемшілік мынау: тозаңқап қабығынан бөлініп қоректік ортаға шығатын заттар жеке тозаңдағы эмбриогенез процесін тежеуі мүмкін. Бұдан басқа, андрогенезге қабілеті жоғары генотиптердің тозаңқаптарын қолайлы жағдайда өсіргенде, олар микроспоралардан жаппай каллустар мен эмбриоидтарды бір мезгілде алуға бөгет болады. Сондықтан жеке бөліп алынған тозаңдарды өсіру тиімді болады. Бірақ, тозаңқапты жарып жіберіп, тозанды шығарып алу әдісін тек кейбір тозанкаптары ірі және тозанкап ішінде тозандары бос жататын өсімдік түрлеріне қолдануға болады (мысалы Datura,Petunia, Nicotiana, Brassica. ).

Бірінші рет 1973 жылы сасықмеңдуананың тозаңын өсіріп, оларда эмбриоидогенез процесі жүруін байқаған К. Нич пен Б. Норел болды. Көбінесе тозаңқапты өсіріп, регенерант өсімдіктерін алу тиімді. Бірақ астық тұқымдастарында тозанды тозаңқаптан бөліп алу өте қиын. Ол үшін тозаңқаптарды сұйық ортада қалқытып, шайкап өсіру әдісі қолайлы. Тозаңқаптар жарылып ашылады да, тозаң өздігінен шашылып, қалқып ортанын бетіне шығады. Сұйық ортада қалқып жүрген тозаңқаптарды алып тастайды, ал олардан шыққан микроспораларды одан әрі өсіре береді. Тозаңқаптардан биологиялык активтігі бар заттар шайылып шығып, қоректік ортаның құнарлығы артады, яғни тозанның өсуіне барынша қолайлы фиозиологиялық жағдай туады.

Кейбір өсімдіктердің (соның ішінде астық тұқымдастары) тозаңқаптарын сұйық ортаға саларда оларды өткір скальпелдің ұшымен екіге бөліп жібереді. Щ.Тивари арпамен өткізген тәжірибесінде бүтін тозаңқаптарды сұйық ортада үш тәулік бойы өсіргенде, олардың 60-70 % микроспоралары өз бетімен ортаға шыққан. Ал кесілген тозанқаптарды сұйық ортаға 4 сағат бойы шайқап өсіргенде, олардың 90 % микроспоралары сыртқа шыққан. Алдын ала тозаңқаптарды кесіп тіліп сұйық ортада өсірген соң, ортаны сүзіп жіберіп, центрифугадан өткізіп, микроспоралары көп фракцияны алған.

Іn vitro жағдайында эксперименттік жолмен гаплоидтарды шығару әдісінің кең таралуына екі ірі кемшілік тегеурін болады:

1) гаплоидтық өсімдіктерінін аз алынуы;

2) олардың арасында (әсіресе астық тұқымдастарында) альбиностардың көп кездесуі. Айта кететін жай, тозаңды өсіргенде альбинос регенеранттардың саны арта түседі, мүмкін ол тозаңның дамуының дұрыс өтпеуіне байланысты болар. Жалпы алғанда альбинизм себебі белгісіз.

In vitro өтетін андрогенезге әсер ететін факторлар. Іn vitroжағдайында андрогендік гаплоидтарды алу әдістері және осы құбылыстың теориялық негіздері жете зерттелмеген. Сондықтан гаплоидтық биотехнология жүйесін қалыптастыру талай қиыншылықтарға кездесіп жүр. Микроспораның түрлі даму кезеңдерінде өтетін морфофизиологиялық процестерінің ішкі және сырткы факторларымен қалай реттелетіні, микроспораның тотипотенттігін жүзеге асыру үшін қандай жағдайлар қажет екені т.с.с. мәселелер әзірше белгісіз болып отыр. Бұл жағдай зерттеушілерді осы маңызды істі эмпирикалық жолмен шешуге мәжбүр етеді, яғни әрбір өсімдіктің түріне, сортына лайық жағдайды тәжірибе арқылы іріктеп алу керек болады.

Андрогенездің тиімділігі (көп гаплоид алу) бірімен бірі өзара байланысты көп факторларға тәуелді: донорлық өсімдіктердің генотипі, олардың өскен жағдайлары, микроспоралардын даму кезеңі, эксплантты алдын ала өндеу, қоректік ортаның құрамы, гүл тозаңдарын өсіру әдістері т.б.

Іn vitroжағдайындағы андрогенезді шектейтін негізгі фактор - донорлық өсімдіктің генотипі. Туыстар ішіндегі түрлер тұрмақ тіпті бір түрге жататын сорттардың регенерацияға қабілеті бірдей болмайды. Мысалы, күріштің жапон түртармағының сорттары тозаңқаптан регенерант өсімдіктерін үнді тұртармағымен салыстырғанда артық шығарады. Арпа мен бидайдың көптеген генотиптерінің андрогенездік қабілеті сыналған. Мұндай қабілет арпада 0 мен 31,6 % арасында, бидайда - 0 мен 14,7 % дейін байқалған.

Көптеген зерттеулердің нәтижелері көрсеткендей, генотип пен іn vitroжағдайында өтетін морфогенездің өзара байланысы өте күрделі, әсіресе бұл даражарнақты өсімдіктерде байқалады. И. Василдін пікірінше экспланттың морфогенезге қабілеті донорлық өсімдіктің генотипіне қарағанда көбінесе оның физиологиялық күйіне байланысты. Тіпті физиологиялық күйіне сәйкес өсіру жағдайын жақсартып, генотиптің андрогенезге көрсететін ықпалын төмендетуге болады. Донорлық өсімдіктерді өсіру жағдайы андрогенездін тиімділігіне әсері бар екендігі айқын анықталған. Мысалы, егістік жерде өскен өсімдіктердің тозаңқаптары теплицада өскен өсімдіктермен салыстырғанда регенерант өсімдіктерін артық шығара алады. Шамасы, бұл сыртқы факторлардың комплекстік әсерінің нәтижесі болар.

Микроспоралардан каллустар мен эмбриоидтар түзілу жиілігіне донорлық өсімдіктерге ықпал еткен әр түрлі физикалық және химиялық факторлардың (төмен және жоғары температура, топырақта азоттың жетіспеушілігі т.б.) әсері көрсетілген. Осы факторлардың ішінде ең маңыздысы - температура. Донор өсімдіктерді алдын ала суықпен өндеу арқасында эмбриоидтардың түзілу жиілігі артады. Бірақ температура және оның ықпалының ұзақтығы өсімдік түріне, тозанның даму кезеңіне, оның бөлініп алынған уақытына сәйкес болуы қажет.

Салқын температурамен әсер етуді түрлі тәсілдермен өткізуге болады. Мысалы, арпа мен бидайдың тозаңқаптары мен тозаңын өсіру үшін 3 тәсіл қолданылады:

1. Тиісті кезеңде донорлық өсімдіктің басты сабағы кесіліп алынып, суға салынып, суықта ұсталады. Бидайды 3-5 тәулік бойынша 5-7°С температурада ұстайды, арпаны - 6-10 тәулік 7°С ұстайды. Одан кейін масақты кесіп алып, залалсыздандырады да гүлдері мен тозаңқаптарды бөліп алады.

2. Асептикалық жағдайда гүлдер мен тозаңқаптарды бөліп алып, стерильденген орташа Петри табақшаларына бөлек салады. Басқа залалсыздандырылған Петри табақшасына стерильді су құйылады. Барлық табақшаларды қақпақсыз үлкен Петри табақшасына қойып, қақпағын жауып, лентамен жабыстырып, суыққа қояды. Арпаны 28 тәулік бойынша 4°С немесе 14 тәулік 7°С ұстайды.

3. Масақтарды Мурасиге-Скугтыңқоректік ортасының минералдық бөлігі құйылған көлемі 50-100 мл колбаларға отырғызады. Масақтар мен колбаның мойның полиэтиленпленкасымен орап, 12°С температурада жарыққа (20 мың лк) қояды. Осылай қажет даму кезеніне жеткенше ұстайды, одан кейін колбаны қараңғыда 4°С температурада 14-21 тәулік ұстайды.

Андрогенездің индукциясында микроспоралардын даму кезеңі маңызды роль аткарады. Ең қолайлы - мейоздың аяқталар тұсындағы екі ядролық кезең. Тозаңқаптарды лайыңты даму кезенінде өсіре бастаса, олардың ішіндегі тозаңдарда көбінесе эмбриоидогенез басталып, кейін регенеранттар шығады.

Әр түрлі өсімдіктерде микроспоралардың эмбриоидогенезге қабілетті тобы бар екендігі анықталған. Оларды Р-тозаңшалар деп атайды. Олардың басқа микроспораларға карағанда көлемі кішірек, цитоплазмасы ақшыл, экзинасы жұқа, крахмалы болмайды, кейде косымша митоздардың аркасында көп ядролык болады. Бұл құбылысты тозаң диморфизмі деп атайды. Іn vivoжағдайында Р-тозаншалардың пайда болу жиілігі мен іn vitroжағдайында эмбриоидогенез өтудін жиілігі арасында корреляция, яғни өзара байланыстылық болады. Эмбриогендік микроспоралардың іп vivoпайда болуы өсімдік түрінің генетикалық ерекшеліктерімен белгіленеді. Бірақ ол қабілет өсімдікті өсіру жағдайына байланысты өзгеруі мүмкін.

Андрогенездің тиімділігіне қоректік орта мен өсіру жағдайлары үлкен әсер етеді. Көбінесе пайдаланылатын Мурасиге-Скуг ортасы, Гамборгтың ортасы. Сұйық ортада микроспоралар тез каллус түзеді, бірақ регенерацияның тиімділігі төмен болады, сондықтан көбінесе тозаңқаптарды қатты, яғни агарлы ортада өсіреді. Алайда, агардың құрамында тозаңның өміршендігіне зиян заттар болады. Сондықтан агар орнына агарозаны, крахмалды қолданады немесе ортаға активтелген көмір қосылады. Олар ортадағы тозаңқаптың қабығынан және пайда болған андрогендік құрылымдардан бөлініп шығатын зиянды заттарды өзіне сіңіреді. Кейбір өсімдіктердін тозаңқаптарын «қос қабат» тәсілімен өсіреді: Петри табақшаларының түбіне агарланған активтелген көмірі бар орта салынады, ал тозаңқаптар соның үстіне құйылған сұйық ортада өседі.

Тозаңқаптарды отырғызу тығыздығы қоректік ортанын түріне (қатты, сұйық) және онын бет көлеміне байланысты. Мысалы, арпаның тозаңқаптарын Петри табақшасында сұйық ортада өсіргенде, әрбір миллилитрде 60-тан кем тозаңқап болмауы керек. Ортаны алдын ала онда басқа ұлпаларды өсіріп жақсартуға болады мысалы, арпа үшін алдымен тұқым бүршігін өсірсе орта жақсарады.

Қатты ортаға пробиркада 18-20 тозанкаптарын, ал Петри табақшасына - 60-80 данасын отырғызу керек. Тозаңкапты ортаның үстіне орналастыру бағыты әдетте бакыланбайды, бірак арнайы зерттеулер көрсеткендей, темекі мен сасықмеңдуананың тозанкаптарын ортанын үстіне жалпағынан жаткызғанда жаксы нәтиже алынған. Ал қырққабат үшін қолайлысы, тозанкаптын сырткы жалпак жағымен ортаға отырғызу. Арпада андрогендік құрылымдарынын пайда болу жиілігі тозанкаптарды ортаның бетіне қырынан салынғанда байқалған.

Ортадағы сахарозаның мөлшері өсімдік түріне байланысты 2-ден 12 %-ке дейін болады. Шамасы, бұл сахарозаның осмостыққысымына қатысы бар болғандықтан шығар. Кейбір өсімдіктерүшін ортаға баска көмірсуларды қосқаны жақсы әсер еткен. Мысалы, ортаға мальтоза қосылғанда арпада каллусогенез бен эмбриоидогенез күшейіп, жасыл өсімдіктер көбірек алынған.

Қоректік ортаның гормондыққұрамы өсімдіктің түріне жәнемикроспоранын даму кезеніне байланысты өзгертіліп тұрады. Көптеген өсімдіктерге түрлі амин қышқылдары (казеиннің гадролизаты, аланин, глицин) мен олардың аминдері (аспарагин, глутамин), табиғи қоспалар (ашытқы экстракты, арпа солоды экстракты, «кокос сүті») жақсы әсерін тигізген. Қытай ғалымдары астық тұқымдастарынын тозаңқаптарын өсіргенде ортаға картоп экстрактын қосып, жақсы жетістіктерге ие болған. Картоп крахмалы қоректік қызметінен басқа гель ретінде де қолданылады. Астық тұқымдастарының тозаңқаптарында каллустар мен эмбриоидтар түзілуіне ортада нитраттық азотты көбейту мен аммоний азотын азайту жақсы әсер етеді.

Астық тұқымдастардың ең үлкен кемшілігі, олар андрогендік каллустардын морфогенезге қабілетін тез уақытта жоғалтады.

Генотипіне, даму кезеніне сәйкес қоректік ортаны тағы баска өсіру жағдайларын іріктеу арқылы, андрогендік гаплоидтардьщ негізінде жүгерінің, қара бидайдың, арпанын, темекінің, мақтаның, сояның, қырыққабаттың, бұрыштың, каучук беретін өсімдіктердің көптеген бағалы сорттары шығарылды.

2. Кейбір өсімдіктерді әріден будандастырғанда будан ұрықтың ерте даму кезенінде аталық немесе аналықтың хромосомалары селективті (іріктеліп) жойылады. Бұл құбылыс арпада жете зерттелген. Диплоидтык арпаның екпе түрін (Hordeum vulgare) көп жылдық диплоидтық жабайы пиязшық түріне (Ногdeum bulbosum) будандастырған соң, Ногdeum түріне тән гаплоидтық хромосомалар жиынтығы бар өсімдік пайда болады. Ұрық пен эндосперм өсе бастағанда жабайы түрдің хромосомалары элиминацияға ұшырайды, яғни жойылып кетеді. Ұрықтандырудан кейін 5 күн өткен соң, ұрық пен эндосперм жасушалары бөлінген кезде Н.bulbosum хромосомалары толық жойылады. Әрбір бөлінуде генетикалық сыйымсыздықтың салдарынан 3 хромосома жойылады. Тозаңданудан кейін 15 тәулік өткен соң, аналық өсімдіктегі будан ұрықтың өсуі тоқтайды. Дегенмен, сол ұрықты іn vitro жағдайында өсіріп, сақтап қалуға болады, лайықты қоректік ортада одан қалыпты өскін шығады.

Аналық ретінде қолданғанда, матроклиндік (жүмыртқа клеткасынан шыққан) гагоюидтар шығады. Ұрықты жасанды ортада өсіріп, диплоидтық (2п=14) арпаның, моногаплоидтарын (п=7) алуға болады, ал тетраплоидтық (4п=28) арпадан дигаплоидтарды (2п=14) алуға болады.

Гаплоидтар ұрпақсыз болады, сондықтан оларды міндетгі түрде дигаплоидтық деңгейіне көшіреді. Ол үшін колхицинді колданады. Гаплоидтық организмнен алынған дигаплоид - нағыз гомозигота, таза линия болады. Сөйтіп, бұл әдісті қолданып, гомозигота алудың мерзімі қысқарады. Сонымен бірге организм рецессивтік гендерден айырылады. Бұл әдіспен арпаның әр түрлі сорттары мен будандары алынады, сонымен қатар оның тиімділігі жоғары және альбинос өсімдіктері болмайды.

Осы әдісті қолданып, кейін будан ұрықты іn vitro өсіріп Одессада селекциялық-генетикалық институтында жаздық арпаның Исток пен Одесский-15 деген жаңа сорттары төрт-ақ жылдың ішінде шығарылды, ал әдеттегі селекция әдістерімен оған 10-12 жыл кетер еді. Осы жолмен Канадада арпаның Минго мен Родео сорттары шығарылды. Арпаның жабайы түрін тозандандырғыш ретінде пайдаланып, қара бидай мен бидайдың гаплоидтарын алуға болады.

3. Гаплоидтық өсімдіктерді аналық ұрық мүшелерін өсіру арқылы алу жұмыстары 1950-ші жылдары басталды да, соңғы жылдары бұл зерттеулер жақсы дамыды. Мұның бірнеше себептері бар. Біріншісі, цитоплазмалық аталық ұрықсыздығы бар өсімдіктердің гаплоидтарын алу үшін ұрықтанбаған тұқым бүршігін өсіру қажет. Темекі мен қант қызылшасының цитоплазмалық аталық ұрықсыздығы бар линияларынан осы әдіспен гаплоидтар алынған. Екіншісі, кейбір өсімдіктердің каллустарының морфогенезге қабілеті өте төмен немесе тозаңқаптарды өсіргенде тек альбинос регенеранттары алынады. Тұқым бүршігінен шыққан өсімдіктер көбінесе жасыл болады, мысалы арпада, күріште.

Тұқым бүршігін өсіріп гаплоидтық өсімдіктерді алу гиногенез деп аталады, бұл апомиксистін бір формасы. Апомиксис - организмнің жыныссыз жолымен көбеюі. Оның екі жолы болады - партеногенез бен апогамия. Партеногенез - организмнің ұрықтанбаған жұмыртқа жасушасынан дамуы, бұнда ұрпақ аналық генотипін қайталайды. Ұрық гаплоидтық немесе диплоидтық бола алады. Апогамия (апогаметия) - гаметалар түзілмейді, ал ұрық (галлоидтық немесе диплоидтық) синергидтан немесе антиподтан дамиды. Жалпы алғанда, апомиксис табиғи жағдайда кездесетін құбылыс, ал биотехнологиялық әдістермен онын тиімділігін арттыруға болады.

Аналық гаметофттің іп vitro жағдайында дамуы.Өсімдіктердің аналық гаметофиті ұрық қапшығы -нуцеллуспен және интегументтермен қапталған тұқым бүршігінің ішінде жатады. Тозаң түтікшесі енетін тұқым бүршігінің ұшындағы тесік микропиле деп аталады, оған қарама-қарсы тұрған бөлігін халаза деп атайды.

а - сыртқы интегументі; 6 - ішкі интегументі; в - нуцеллус;г - ұрыққалтасы.

Сурет 10. Ортотропты тұқым бүршігінің ұзынынан тілігі

Тұқым бүршік түқымсағақ арқылы бүрбүртігіне бекітіледі. Микропиле, тұқымсағағы және нуцеллустың орналасуына қарай тұқым бүршігінің 5 түрін ажыратады. Солардың бірі - ортотропты, яғни тік орналасқан тұқым бүршігінің түрі.Гүлді өсімдіктердің тұқым бүршігі түйінде түзіледі. Әдетінше ұрық қапшығының нормалы түрі тұқым бүршігінің нуцеллусында пайда болған мегаспораның бір жасушасынан дамиды. Ол үш рет бөлініп 7-жасушалық және 8-ядролық, жасушалары ретімен орналасқан құрылымға айналады.

	Синеогидтар
	Жұмыртқа жасушасы
	Диплоидтық ядролық орталық жасуша
	Антиподтар

1 - екі ядро, 2- төрт ядро; 3 - сегіз ядро; 4 - пісіп жетілген ұрық қалтасы.

Сурет 11. Ұрық қалтасының дамуы

Ұрық қалтасы ірі жұмыртқажасушасынан және онымен жанасқан ұсақ екі қосалқы синергидтар деп аталатын жасушалардан тұрады. Бұдан басқа қос ядролық орталық жасуша және халаза жағында тағы үш бірдей жасушалар - антиподтар болады. Орталық жасушадан басқаларының барлығы гаплоидтық болады. Орталық жасушада екі гаплоидтық жасушалар қосылып, диплоидтық ядроны түзеді. Қосарлы ұрықтану нәтижесінде ұрыққа бастама болатын диплоидтық зигота түзіледі, ал орталық жасушадан үшплоидтық эндосперм дамиды.

Тозаңшамен салыстырғанда ұрық қалтасы морфология және физиология жағынан едәуір күрделі құрылым. Сондықтан аналық гаметофиттен гаплоидтық өсімдіктердің шығуында өз ерекшеліктері бар. Гаплоидтық өсімдіктер аналық гаметофиттің іn vitro аномальды дамуынын нәтижесінде пайда болады. Оның екі жолы бар: эмбриоидогенез және каллустағы органогенез.

Түйін мен тұқым бүршігінде пайда болған әлдеқандай жағдайдың арқасында ұрық қапшығында генетикалық белгіленген дамужолы бұзылады. Соның нәтижесінде кейбір жасушалар дифференцировканың тұйығынан шығып, жаңадан дамып, аяғында апомиксистік ұрықты түзеді. Бұл ұрықтардын құндылығы, олар тек аналық белгілерін сақтап тұқым қуалайды. Табиғи апомиксис және іn vitroжағдайында ұрықтанбаған түйіндер мен тұқым бүршіктерін өсіргенде, жоғарыда атаған процестері шамасы ұқсас өтеді.

Гаплоидтық эмбриоидтар мен каллустар ұрық қапшығының жалғыз немесе бірнеше клеткаларынан түзілуі мүмкін.

Арпаның ұрықтанбаған түйіндерін өсіріп, гаплоидтық өсімдіктерін алған Сан Ноум мынаны байқады. Эмбриоидтар ұрық қапшығының кез келген жасушаларынан түзілген: 1) жұмыртқа жасушадан; 2) жұмыртқажасушасы мен антиподтардан; 3) жұмыртқажасушасы мен бір синергидтен; 4) жұмыртқажасушасы мен екі синергидадан; 5) бір немесе екі синергидтен; 6) синергидтар мен антиподтардан.

Оның болжауынша арпада гаплоидтық эмбриоидтар көбінесе антиподтардан, ал каллустар - синергидтардан түзіледі.

Өсірген түйіндер мен тұқкым бүршіктердің цитологиялық және цитогенетикалық зерттеуін өткізгенде, ұрыққапшығын қоршаған сомалық жасушаларының да пролиферациясы өтетіндігі анықталған. Нуцеллус пен интегументтерден диплоидтык және Іполиилоидтық өсімдіктер пайда болған. Цитрустар мен манго өсімдіктерінде нуцеллустан ұрықтың түзілуі табиғатта жиі кездеседі.

Ұрық қапшығы жасушалары мен оны қоршаған ұлпаларда мынадай морфогендік процестер өтеді: 1) гиногенез (жұмыртқажасушасынан), 2) апогаметия (синергидтар мен антиподтардан); 3) адвентивтік эмбриония (нуцеллус пен интегумент жасушаларынан түзіледі).

Сурет 12. Бидайдың ұрықтанбаған түйіндерін іп vitroөсіргенде өтетін морфогендік процестер

Аналык гаметофиттің іп vitro жағдайында дамуына әсер ететін факторлар. Гаплоидтық өсімдіктер шығу процесіне бірсыпыра ішкі (донорлық өсімдіктің генотипі, ұрық қапшығының даму кезеңі) және сыртқы (қоректік ортаның құрамы, өсіру жағдайлары) факторлар шектеу әсерін тигізеді. Аналық гаметофитті өсіргенде гаплоидтық өсімдіктердің түзілуі генотипке байланыстығы жүгеріде, темекіде т.б. түрлерінде көрсетілген. Ұрықтанбаған түйіндер мен тұқым бүршіктерін өсіргенде, тозаңқаптарды өсірген сияқты донорлық өсімдіктің генотипіне мән беру кажет. Өйткені бір сортқа іріктеп алынған жағдайлар екіншісіне жарамауы мүмкін.

Ұрықтанбаған түйіндер мен тұқым бүршіктерін өсіргенде тағы бір елеулі фактор - олардың даму кезеңдері. Ұрық қапшықтың даму кезенің дұрыс анықтау үшін тұрақты парафинделген препараттарды дайындау қажет, ал оларды алу өте күрделі және ұзаққа созылатын жұмыс. Сондықтан ұрық қапшығының даму кезенін әдетте жанама жолмен анықтайды. Атап айтқанда, микроспораның даму кезеңіне немесе өсімдіктің фенологиялық даму кезеніне қарап. Морфогенез процестері ұрық қапшығында әр түрлі даму кезендерінде басталуы мүмкін.

Гаплоидтық өсімдіктерді осы әдіспен алу үшін қоректік ортаныңн маңызы зор. Көбінесе Мурасиге-Скугтың, Миллердін, Ничтің №6 орталары колданылады. Әсіресе фитогормондардың түрі мен мөлшері үлкен роль атқарады. Кейбір өсімдіктер үшін ауксиндер мен цитокининдер керек болса, басқаларына тек қана ауксиндер қажет.

Фитогормондардын жоғары концентрациялары көбінесе түйіннің сомалық ұлпаларынан каллустың шығуына себеп болған. Бидайдың ұрықтанбаған түйіндерін өсіргенде, эмбриоидогенез өту үшін ең тиімдісі 2,4-Д мен кинетин (6-10 мг/л) қосылған Мурасиге мен Скугтын ортасы болған.

Сондай-ақ витаминдер, казеин гидролизаты, кокос сүті, ашытқы экстракты т.с.с. жағымды әсер етеді. Бірақ олардың мөлшері тәжірибе арқылы іріктеліп алынады. Сонымен бірге көмірсулардың (глюкоза, фруктоза, сахароза) маңызы зор. Астық тұқымдастарының көбі сахарозаның жоғары концентрациясын талап етеді, мысалы, бидай - 8-14 %, арпа - 3-10 %.

Әдетте түйіндер мен тұқым бүршіктерін қатты ортада 23-28°С температурада, жарықта немесе караңғыда өсіреді, бірақ тәжірибе көрсеткендей, күріштің, мақтаның, бидайдың аналық гаметофиттерін сұйық ортада өсіру тиімдірек.

4. Гаплоидтық жасушалар мен протопластар жасушалардың бөлінуі мен дифференциялануың, сомалық жасушалардың генетикасын және популяциялардың генетикасын зерттеу үшін ыңғайлы эксперименттік модель. Гаплоидтық өсімдіктер практикалык селекция мен теориялық зерттеулерде қолданылатын өте құнды генетикалық материал.

Гаплоидтарды пайдаланып, яғни хромосомалар санын екі есе арттырып, гомозиготаларды жылдам алуға болады. Гаплоидтық өсімдіктерді колхицинмен өндесе, хромосомалары мүлде ұқсас гомозиготалық дигаплоидтық организм пайда болады. Гаплоидтар ұрықсыз болады, себебі гомологиялық хромосомалары болмағандықтан мейоз процесі бұзылып, аномальдық хромосомалар жиынтығы бар гаметалар түзіледі. Хромосомалар екі еселену арқылы гаплоидтық өсімдік гомозиготалықк диплоидтық ұрықты өсімдікке айналады.

Әріден будандастыру арқылы алынған будандардың гаплоидтарын шығарып, олардың дигаплоидтарынан тұрақты гомозиготалық сорттарды шығару әсіресе маңызды. Әріден будандастырғанда түраралық, туысаралық, тіпті буданаралык будандастыру нәтижесінде гетерозис құбылысы орын алады. Дигаплоидтарды алу арқылы гетерозисты сақтап қалу өте маңызды. Екі еселенген гаплоидтардың негізінде гетерозистық будандарды алу үшін қажетті изогендік линияларын бір жылдың ішінде шығаруға болады, ал әдеттегідей инбридинг әдісімен бұған 4-6 жыл кетеді. Гаплоидтық өсімдіктерде рецессивтік гендік мутацияларды анықтау оңай, себебі олар доминанттық аллелъдермен бүркелмейді.

Андрогенезді қколдану гаплоидтық селекциямен шектелмейді. Гаплоидтық жасушалардан алынған протопластарын косып будан өсімдіктерді алуға болады. Гаплоидтық протопластардың көзі ретінде тозаңқаптар мен микроспоралардан іп vitroжағдайында пайда болған каллус жасушалары мен басқа андрогендік құрылымдар (глобулалар, эмбриоидтар) болады. Екі гаплоидтық протопласт қосылып, диплоидтық будан клетка түзіледі, одан кейін будан регенерант өсімдік пайда болады.

Сомалық будандардың гаплоидтық протопластардан алынуы генетикалық алуан түрлілікті едәуір кеңейтеді, себебі бұл кезде сомаклондық өзгергіштікпен бірге гаметоклондық өзгергіштік орын алады.

Микроспораларды өсіргенде, оларда мутагенезді тудырып мутант өсімдіктерді шығаруға болады. Өсіріп жаткан микроспораларды түрлі химиялық немесе физикалык мутагендік факторлармен, патотоксиндермен, гербицидтармен, зиянды тұздармен т.б. өңдегенде, олардын көбісі құрып кетеді. Ал сол факторға төзімді азғана микроспоралар тіршілікке икемділігін сақтап қалады. Олар кейін бөлініп андрогендік құрылымдарды және де регенерант өсімдіктерін шығарады. Бұл микроспораларда өткізілетін мутагенез және клеткалык селекция. Елеулі айырмашьшығы, ол алынған регенерант өсімдігі гаплоидтық болғандықтан, мутант өсімдіктер басқалардан оңай ажыратылады. Бұл бағытпен түрлі қолайсыз факторларға, соның ішінде бактериялар мен саңырауқұлақтар қоздыратын ауруларға төзімді өсімдіктердің жана формаларын шығаруға болады.

Тақырып 10. Клеткалык инженерия..

Мақсаты: Өсімдік жасушаларының іn vitro жағдайында өзгергіштігі және оны селекцияда қолдануды, жасушалық селекция негіздерін, төзімді жасушаларды сұрыптауды, сомаклондық варианттарды таныстыру.

Жоспар:

1. Протопластарды будандастыру. Жасушаны қайта құрастыру.

2. Оқшауланған протопластарға негізделген клеткалық инженерия әдісі.

3. Протопластарды бөліп алу. Тіршілікке қабілетті протопластарды алу.

4.Протопластардын бір-бірімен құйылысып косылуы.

5. Өсімдіктердін клеткалық инженериясы

1. Жасушалық инженерия - жасушаларды өсіру, оларды будандастыру және қайта құрастыру арқылы жасушаның мүлдем жаңа типін жасау әдістерінің негізінде қалыптасқан биотехнологияның саласы. Жасушаларды жасанды жолдармен будандастырғанда, сомалық (жыныстық емес) жасушаларды бір-біріне қосқанда будан геном түзіледі. Будандастырудың бұл тәсілінде аталық және аналық жасушалар ретінде жыныстық жасушалар (гаметалар) емес өсімдіктің дене (сомалық) жасушалары қосылады. Алдын ала протопластарын бөліп алады, белгілі жағдайда олар бір-бірімен құйылысады. Пайда болған сомалық будан клеткадан кейін регенерация арқылы будан өсімдіктер өсіп шығады.

Протопластарды қосу арқылы будандастыруды әр түрлі атайды: сомалық будандастыру, парасексуальды будандастыру, жыныстық емес будандастыру.

Жасушаны қайта құрастыру (реконструкция) - жасушаның құрамына кіретін ядроны, цитоплазманы, митохондрияларды, хлоропластарды, хромосомаларды бір жасушадан басқа клеткаға көшіру негізінде мүлдем жаңа жасушаны жасау. Осындай әрекеттер нәтижесінде ядролық және цитоплазмалық гендер тіркестігі әдеттегідей емес, тіпті өзгеше жасушалар пайда болуы мүмкін. Одан да артық ғалымдарды қызықтыратыны, ол жеке хромосомаларды тасымалдау арқылы анеуплоидтық линияларды алу мүмкіншілігі. Протопласт бөтен ДНК-ны қабылдай алатын өте ыңғайлы жүйе. Сол ДНК клеткаға енгізіп және оның экспрессиясын қамтамасыз ету арқылы генетикалық өзгертілген өсімдіктерді алуға болады. Протопласт деген ферменттердің әсерімен немесе механикалық әдістермен қабығы түгел жойылған өсімдік жасушасы. Ағылшын ғалымы Э. Кокинг 1960-шы жылдардың басында жасушаның ішіндегі протопласты зақымдамай тірі күйінде бөліп алу әдісін жете зерттеп дайындады. Ол томат тамырларының ұштарың зең саңырауқұлақтар өсірген ортасына бөліп шығарған гидролиздік ферменттерімен өңдеп, протопластарды ферменттік әдісімен бөліп алды.

Сурет 13. Жасушалық инженерия әдісі.

Әдетте тірі жасушада протопласт жасушаның қабырғасына орталық вакуольдің тургор, яғни кернеулік қысымымен тығыз жанасып тұрады. Жасуша қабығы арқылы плазмалеммамен қоршалған цитоплазмалық жінішке жіпшелер өтеді, солар арқылы көршілес клеткалардың протопластары біріне-бірі жалғасып жатады. Сондықтан жасуша қабығын ферментпен еріткен кезде, протопластарға зиян келтірмей клеткаларда плазмолизді жүргізеді.

1. Өсімдік жасушалары іn vitro өсіргенде әр түрлі өзгерістерге ұшырайды. Ол генетикалық, морфологиялық, физиологиялық өзгерістер. Тіпті жеке бір жасушадан тараған оның ұрпағы да, яғни жасушаның клоны, хромосомалық өзгергіштік салдарынан тез арада әркелкі болып кетеді.

Өсірген жасушаларда пайда болған өзгерістердің кейбірі тұқым қуалайды, кейбірі тұқым қуаламайды. Тұқым қуаламайтын өзгерістерді модификация деп атайды. Модификациялық өзгергіштік жасушалардың тіршілік жағдайына бейімделуіне көмектеседі. Тұқым қуалайтын, яғни генетикалық өзгерістердің практикада қолдануға маңызы зор. Генетикалық өзгерістердің негізінде жеке гендердің мутациялары, амплификация, делеция, ядродан тыс орналасқан гендердің өзгеруі, хромосомалар құрылымындағы ауытқулар жатады. Тұқым қуалайтын өзгерістердің негізінде генетикалық өзгерістермен қатар эпигенетикалық өзгерістер де жатады, басқа сөзбен айтқанда, жалпы геномда өзгеріс болмайды, тек организмнің дамуы кезіңде гендердің экспрессиясы ғана өзгереді.

Жасушалардың өзгергіштігін әр түрлі мутагендермен әсер ету арқылы арттыруға болады. Өздігінен өтетін (спонтандық) және әдейі әсер ету арқылы қоздырылатын (эксперименттік) мутагенез, жасушалық технологияларда және селекциялық жұмыстарда пайдалану үшін қажетті генетикалық алғашқы материалды (жасушалық штаммдар, өсімдіктің жаңа генотиптері т.б.) шығаратын әдіс. Іп vitroөсетін жасушалардың тұрақсыздығы арқасында генетикалық өзгерген регенерант өсімдіктер шығады. Мұндай өсімдіктерді сомаклондық вариантгар деп атайды.

Сомаклондық варианттарды селективтік қоректік ортада жасуша деңгейінде сұрыптап алу өте тиімді. Себебі жасуша денгейінде сұрыптау селекциялыұ жұмыстың көлемін қысқартып, оның тиімділігін арттырады. Өйткені іп vitro өскен миллион жасушаларды талдаудан өткізу, миллион генотипті талдаумен тең. Мұндай жағдайда генетикалық өзгерістері селективтік ортаға жасушалар ғана тіршілікке икемді келеді. Сондай сұрыпталып алынған жасушалар пайдалы қасиеттері тұқым қуалайтын жасушалық линияларға бастама бола алады. Ол жасушалық линиялардан регенерация процесі арқылы әр түрлі стрестік факторларға төзімді өсімдікті сынақтан өткізіп таңдап алуға мүмкіндік туады.

2. In vitro өсірілген жасушалардың арасынан нақтылы бір селективтік жағдайға сәйкес өзгеріске ұшырап, пайдалы қасиетке ие болған жасушаларды көбейтіп сұрыптап алуды жасушалық селекция дейді. Әрбір жасушадан өсімдік шыға алатын болғандықтан, жасушалық селекцияны қолданып өсімдіктердің жаңа формаларын тез алуға болады. Оларға бастама болған жасуша белгілі бір төтенше факторға төзімді келсе, одан шыққан өсімдікте көбінесе сол қасиетті сақтай алады.

Жасушалық селекцияның артықшылығы мынада: жыл он екі ай маусымға тәуелсіздік және уақыт пен егіс көлемінің үнемделуі, жасушалық популяцияның әрбір жасушасын жеке организм деп теңесе, бір тәжірибенің өзінде-ақ миллиондаған дарақпен айналысуға болады. Ал дала жағдайында ең көп дегенде ғалым мыңдаған ғана өсімдіктермен жұмыс істей алады.

Жасушалық селекцияның әдістері. Селекцияны қажетті бір бағытта өткізу үшін, яғни өсіп жатқан жасушалардың арасынан белгілі мутациялары бар жеке, жасушаларды сұрыптау үшін оларды арнайы селективтік ортада өсіреді. Сондай жағдайда тек мутант жасушалар ғана өсе алады. Іn vitro жағдайында селекцияны амин қышқылдар аналогтарына, нуклеотидтер аналогтарына, патотоксиндерге, антибиотиктерге, гербицидтерге, тұздар мен ауыр металдардын жоғары концентрацияларына, төмен рН көрсеткіштері мен басқа да түрлі-түрлі факторларға төзімді клеткалық линияларды сұрыптап алу үшін жүргізеді. Сондай-ақ гормондарға, витаминдерге, амин қышқылдарына прототрофтық немесе ауксотрофтық жасушаларды сұрыптайды, яғни сол заттар ортада болмағанда немесе болғанда ғана өсе алатын жасушалар іріктеліп алынады. Егер де белгілі бір затқа төзімді жасушаларды сұрыптап алу керек болса, оларды сол зат қосылған ортаға егіп өсіреді. Ал енді нақтылы стресс факторға төзімді клеткаларды сұрыптап алу мақсаты болса, онда ішінде жасушалар өсіп жаткан ыдыстарды дәл сондай жағдай (төмен немесе жоғары температура, гипоксия т.с.с.) әсер ететін жерге орналастырады. Біраз мезгілден соң жасушалардың көбі бөліне алмай, өсе алмай құриды, тек мутация немесе эпигенетикалық өзгерістер арқасында сол факторға төзімділік көрсеткен жасушалар ғана тірі қалады. Бұндай әдісті тура селекция деп атайды. Осындай тәсілді кейбір метаболитгерді (мысалы, амин қышқылын) көп мөлшерде түзіп өндіре алатын жасушаларды алу үшін қолданады. Амин қышқылының аналогын өзіне сінірген жабайы жасушалар өледі, себебі полипептидтер дұрыс түзілмейді, белок синтезі бұзылады. Өйткені амин қышқылының орнына онын аналогі полипептидтін құрамына кіріп кетеді. Ал мутанттар сол амин қышқылың баска жасушалардан гөрі артық түзетіндіктен белок синтезі дұрыс өтеді, ондай жасушалар тірі қалады.

Кері немесе негативтік селекция. Бұл әдіс бойынша жабайы жасушалардың жедел бөлінуіне жағдай жасалады. Сонан соң қоректік ортаға әдейілеп тимидиннің аналогін қосады. Оның молекулалары тимидиннің орнына ДНК құрамына енеді. Соның салдарынан ДНК синтезі бүлінеді де, жабайы клеткалар кыска уақыт ішіниде құрып кетеді («летальдық өсу» әдісі). Ал мутант жасушалар бөліне алмайды, өспейді, бірақ тірі қалады. Басқаша айтқанда, қажетті қасиеттері бар жасушалар өспеу үшін ерекше жағдай туғызылады. Содан кейін тірі қалған мутант жасушаларды қолайлы қоректік ортаға көшіріп, көбейтіп өсіріп, тұрақты линияларды алады.

Қоректік ортаға қосатын ингибитордың (селективтік агенттің) концентрациясы нақтылы жасушалар линиясының сезімталдығына байланысты. Сондықтан қоректік ортаға әрбір селективтік фактордың әр түрлі концентрациясы қосылған жеке-жеке ыдыстарға жасушаларды салып, олардың өсу қарқындығын анықтайды. Яғни концентрациялардың кең диапазонын жасап, жасушалардың өсуін тоқтататын минималдық және максималдық концентрациясын табу керек.

Жасушаларды өсіргенде қоректік ортаға кейбір амин қышқылдарының уландыратын концентрациясын немесе олардың аналогтарын қосып сұрыптау нәтижесінде сол амин қышқылдарын мол синтездейтін мутанттар алынған. Ондай мутанттар қажетті амин қышқылын асыра синтездейді, сондықтан оның аналогін өзіне онша сіңірмейді. Осылай, алғашқы жасушалармен салыстырғанда триптофанды 20-30 есе артық синтездейтін, және де 5-метилтриптофанға (триптофанның аналогі) төзімді сәбіз бен темекі клеткаларының штамдары іріктеліп алынды. Осы әдіспен картоптың, сәбіздің, күріштің, сасықмендуананың және баска өсімдіктердің лизин, метионин, пролин, фенилаланин, глицинді асыра синтездейтін бірқатар жасушалық линиялар алынды.

Коректік ортаға қосылған кейбір амин қышқылдарының жоғары концентрациясының улылығы мына екі себепке байланысты болуы мүмкін:

1) нақтылы амин қышқылының биосинтезі жүйесіндегі ңандай да бір ферментінін активтілігі тежелуі салдарынан онымен биосинтез жолы ортаң басқа амин қышқылының түзілуі тоқтап қалады;

2) амин қышқылының концентрациясы қоректік ортада мол болғандықтан нитрат немесе аммонийдің сінірілуі (ассимиляциясы) тежеледі. Сонымен қатар, амин қышқыл аналогтары белоктардың құрамына кіріп, олардың атқаратын қызметін бұзады.

Ауыстырылмайтын кейбір амин қышқылдарын жоғары мөлшерде түзе алатын жасушалардан регенерант өсімдіктерді шығаруға болады. Сөйтіп, әдіс амин қышқылдарың, әсіресе ауыстырылмайтын амин қышқылдарын мол мөлшерде түзе алатын өсімдіктерді алудың тиімді жолы. Сонымен, әр түрлі селективтік жүйелерді қолдану арқылы шаруашылыққа бағалы әр алуан белгілер бойынша селекцияның нәтижелерін енгізуге болады. Атап айтқанда: ауруларға, гербицидтерге, түрлі факторларға (топырақ тұздылығы, ауыр металдар, топырақ қышқылдығы, төмен және жоғары температура т.с.с.) төзімді сорттарды шығаруға мүмкіндік туады.

Клетка денгейінде өткізілген селекция әдісімен собық, сабақ, жапырақ гельминтоспориозына төзімді жүгері линиялары, теңбіл ауруын қоздыратын вирусқа төзімді темекі өсімдіктері алынған. Осы әдіспен гербицидтерге, топырақ тұздылығына, өнеркәсіптік ластау әсеріне (ауыр металдар) төзімділігі жоғары «бидай, арпа, күріш, томат, кияр сорттары алынған. Мысалы, Жапонияда теңіз суымен (түзды су) суаруға шыдайтын күріштің сорты шығарылған.

Тұздарға, кейбір патотоксиндерге төзімді жасушалардың клондарынан шыққан регенерант өсімдіктері сол төзімділік белгісін әрқашан сақтап қалмаған. Бұл жағдай төзімділік механизмдерінің жеке жасуша мен тұтас өсімдіктер денгейінде бірдей емес екенін дәлелдейді және де әрбір факторға төзімділікті бақылау жөнінде генетикалық зерттеулерді керек етеді.

Пайда болған өзгерістердің мутациялар салдарынан болмауы да мүмкін. Олар модификациялық өзгергіштіктің нәтижесінде пайда болса, онда тұқым қуаламайды. Бұл өте күрделі жұмыс, себебі мутацияны дәлелдеу үшін мынадай белгілері болуы керек:

1) өзгерген жасушалар жиілігі өте төмен (1х10⁶ - 10⁷);

2) мутагендерді қолдану арқылы оарды арттыруға болады (1x10⁴-10 ⁵);

3) өзгерген жасушалар ұзақ мерзім өсе алады;

4) жаңа белгі селективтік қысым болмаған жағдайда да сақталады;

5) өзгерген ген негізінде түзелетін зат табылады немесе жаңа пайда болған белгі анықталады.

3. Қажет белгісі бар жасушаларды суспензиядан, каллустан, протопластардан сұрыптап алуға болады. Суспензияныпайдаланғанның негізгі артықшылығы, стандарттық микробиологиялық әдістерді қолдану мүмкіншілігі. Өсімдік жасушалар селекциясының көптеген тәсілдері микроорганизмдер мен жануарлар сомалык жасушаларының генетикасынан алынған. Жасушалар топтары көлемінің кішігірімдігі және олардың бірсыпыра физиологиялық гомогендігі, бірден көптеген жасушаларға селективтік фактордың әсерін тигізуге мүмкіндік береді. Көлемі 1л, тіпті одан да аз ортада бірнеше миллион жасушаларды тексеруге болады. Кейде суспензиядағы жасушаларды агарланған ортаға көшіріп отырғызады. Бұндайда әрбір агардыңүстінде өсіп шыккан жасушалар колониясы клон (жеке жасушаұрпағы) болу ықтималдығы зор.

Жасушалардың немесе протопластардың жақсы суспензиясын алуға мүмкіндік болмаған кезде, агарланған қою ортада өсетін жасушаларды қолдану қолайлы. Сонымен қатар, бұндай жасушаларды селективтік фактор суда ерімейтін кезде де қолдануға болады. Бұл жағдайда ол зат органикалық еріткіште ерітіледі де, табакшадағы агардың үстіне тегіс жайылады немесе ерітілген ортаға қосылады. Каллус трансплантыныңжасушалары бұндай ортада тежеуші затпен бірыңғай әрекеттеседі: төменгі жасушаларға жоғарыдағы жасушаларға қарағанда сол заттыңн мөлшері артығырақтиеді. Төзімді жасушалар жақсы өсуінің нәтижесінде біртіндеп көріне бастайды, оларды бөліп алып, селективтік ортаға отырғызып, тұрақты линияларды шығарады.

Төзімді клеткалар линияларың протопластардан сұрыптаудыңөз артықшылықтары бар, себебі протопластарды суспензиядағы жасушалар мен каллустардан ғана емес, бүтін өсімдіктерден де бөліп алуға болады. Одан басқа, протопластарды жасушалық селекцияда пайдаланғанда, жасушалық линия тек кана жалғыз жеке жасушадан шыққанына сенім мол болады.

Төзімді жасушаларды сұрыптау әдісі бір сатылы және көп сатылы болады. Бір сатылы сұрыптау кезінде жасушалар селективтік фактор өте жоғары мөлшерде болған ортада өсіріледі. Бірақ фактордың жоғары концентрациялары барлык жасушалар бір мезгілде құрып кетуіне әкеледі, тіпті төзімді жеке жасушалар да тірі қалмауы мүмкін.

Оған қарағанда көп сатылы сұрыптау тиімді келеді. Онда жасушаларды алдымен селективтік заттың төмен концентрациясы бар ортада өсіреді. Одан кейін жасушалар өсе келе селективті заттың концентрациясы артығыраққоректік ортаға көшіріледі. Мұндай жағдайда тезірек өсетін төзімді жасушалар өсу жылдамдығынан жабайыжасушалардан оза бастайды. Тежеуші заттың концентрациясын біртіндеп өсіре отырып өте жоғары концентрацияда өсетін төзімді жасушаларды сұрыптап алуға болады. Сонымен қатар, көп сатылы сұрыптаудың нәтижесінде төзімділік белгісі ылғи тұрақты болады.

Төзімділік белгісінің тұрақтылығы. Өсу процесін тежейтін факторларға төзімді өсімдік жасушалар линияларын сүрыптауда ен негізгі киындык - сол белгінін түраксыздығы. Ол кейін сүрыптау факторы болмаған кезде айкындалады. Бүндай тұраксыздыктьщ себептері әр түрлі болуы мүмкін. Стресс факторының ықпалымен геномның зақымдануы реверсияларды туғызады. Реверсия немесе кері мутациялар -организмнің мутант күйінен жабайы типке кері көшуі. Немесе стресс факторының әсерімен пайда болған өзгеріс уақытша генетикалық немесе эпигенетикалық адаптация болғаны. Бірақ шамасы түрақсыздық көбінесе жасушалық популяция құрамында жабайы жасушалардың сақталып қалуына байланысты. Стресс факторы болмаған жағдайда олар тез көбейе бастайды да, ақырында мутант жасушалардың орнын басады. Сондықтан жанадан алынған линияларды тұрақтылығы бір қалыпқа түспегенше немесе жасушалар популяциясы тек мутант жасушаларының ұрпағы болмағанынша, яғни жеке мутант жасушаның клоны болмағанша сұрыптаушы жағдайда өсіру қажет. Төзімді және тұрақты жасушалар линияларын қоректік ортаға көшіріп өсіреді. Мұнда тұрақтылығы модификациялық тұқымқуаламайтын өзгергіштікпен белгіленген жасушалар құрып кетеді. Бұл жағдайда сұрыптаушы ортада төзімділігі генетикалық өзгерістер себебінен пайда болған жасушалар ғана жақсы өсе алады. Одан кейін бұл жасушаларды сұрыптаушы факторы жоқ қоректік ортаға көшіріп, тағы да 2-3 пассаж өткізеді. Сонан соң оларды қайталай сұрыптаушы ортада өсіріп, біржолата тұрақты клондарды бөліп алып, регенерант өсімдіктерді шығарады.

Р. Гонзалес пен Дж. Уидхолм әрбір тандап алынған линияны екі түрлі жағдайда өсіруді ұсынады. Линияның бір бөлігін сұрыптаушы ортаға көшіріп өсіреді, екіншісін жай қоректік ортада өсіреді. Осы линиялардың өсу қарқындығын бірнеше айлар бойы қадағалайды. Егер де жай ортада өсірілген жасушалардың төзімділігі айқын төмендеп кетсе, онда сұрыптаушы ортада өсірілген жасушалардан қайтадан клондар алу керек. Қажетті белгісін сақтау үшін тұракты линияларды сұрыптап алған сон оларды тез көбейтіп, клондарын алу керек. Жасушалар линиясы деген бір немесе бірнеше жасушаны көбейту арқылы алынған жасушалар.

Өсімдік клеткалар линияларын алудын ең сенімді жалғыз ғана жолы бар, ол жеке клеткаларды немесе жеке протопластарды осіріп, олардын клондарын шығару.

Индукцияланған мутагенез.In vitro өсірілетін өсімдік жасушалары мутагенез механизмдерін зерттеу үшін және құнды мутанттарды алу үшін өте бағалы экспсрименттік жүйе болып табылады. Мутацияларды жиі-жиі алу үшін түрткі боларлық әр түрлі заттармен немесе әр қилы жағдайлармен әсер етуге, яғни индукциялауға тырысады. Ең тиімді мутагендер болып рентген және ультракүлгін сәулелері, метилметансульфонат, этионин т.б. саналады. Қоректік ортаға қосылған кейбір ауыр металдар да мутагендік әсер етеді.

In vitro өсірген жасушаларды қолданғанда қоректік ортаның азғантай көлемінің өзінде миллиондаған, тіпті миллиард жасушалармен істеуге мүмкіндік туады. Жасушалық селекцияның артыкшылығы, ол жасушаларды біркелкі және бақылаулы жағдайда мутагендермен өңдеу және де оларды тез сұрыптаушы жағдайында өсіру мүмкіншілігі. Осылай өзгертілген жасушалардан кейін жаңа қасиеттері бар, яғни мутант өсімдіктерді шығаруға болады.

Мутагендер төзімді жасушалар клондарынын шығуын арттырады. Мысалы, темекі клеткаларына М-нитрозо-К-метилмочевинамен әсер еткенде пайда болған мутация арқасында олардын HCI-ға төзімділігі асқан. Бірақ мутагендер кездейсок мутацияларды туғызып, қажетті белгілердің пайда болуымен қатар зиян мутацияларды да қоздыруы мүмкін.

Индукцияланған мутагенез әсіресе қосымша метаболиттерді шығаратын мол өнімді жасушалық линияларды алу үшін тиімді пайдаланылады. Мутагеннің тиімділігі гаплоидтық жасушаларың қолданғанда көтеріледі, себебі барлық рецессивтік мутациялар ерте бастан-ақ көрінеді. Мутагеннің тиімділігі протопластарды пайдаланғанда да арта түседі, өйткені протопластар бір ұлпадан бөліп алынғандықтан біркелкі болады. Сондықтан әр түрлі мутацияларды қоздыру үшін әсіресе қолайлысы гаплоидтық өсімдіктердін протопластары. Мутагенез бен жасушалық селекция өсімдіктердің сомалық және жыныс жасушаларын іn vitro өсіргенде, генетикалық өзгертілген өсімдік формалары мен жаңа сорттарын шығарудың тиімді жолдары болып табылады.

4. Генетикалық өзгерістері бар каллус жасушаларынан регенерант өсімдіктер шығару процесінде кейбір мутациялар регенеранттарға өтуі мүмкін. Сондыктан көбінесе регенерант өсімдіктердің бастапқы донорлық өсімдіктерден айырмашылықтары болады. Осындай өсімдіктерді сомаклондық варианттар деп атайды. Бұл ауытқулар тіршілік әрекеттерінің қай-қайсысында да шалуы мүмкін. Осынын нәтижесінде бастапқы өсімдіктен морфологиялық белгілері, онтогенез кезендерінің ұзақтығы, өнімділігі, аурулар мен қолайсыз жағдайларға төзімділігі жағынан айырмашьшықтары бар өсімдіктер пайда болады. Сомаклондық өзгергіштік құбылысын генетикалық өзгергіштік деп түсінуге болады. Сонымен сомаклондық варианттар деп іn vitro жасушаларды өсіргенде генетикалық өзгергішттік нәтижесінде пайда болатын, бастапқы өсімдіктен айныған регенерант өсімдіктерді атайды. Регенерант өсімдік сомаклондық мутант екендігін дәлелдеу үшін жыныстық жолмен көбейетін түрлердің регенеранттарын өздігінен тозаңдандырып және тиісті будандастырулар арқылы генетикалық тексеруден өткізу керек. Жыныссыз жолмен көбейетін түрлерде генетикалық өзгерістер мейоз арқылы берілмейді, сондықтан оларды дәлелдейтін жағдайда клондык көбейтудің тым болмаса екі циклінде жаңа белгінің сақталуы.

Сомаклондык варианттар орнына мына терминдер де пайдаланылады: жасушалық варианттар, варианттық линиялар, фенотиптік варианттар. Протопластардан алынған сомаклондықварианттарды протоклондар деп, ал каллустан алынғанда каллустык клондар деп атайды. Фенотиптік варианттарды бірінші байқаған Д. Шепард еді. Олкартоп протопластарынан мыңдаған регенерант өсімдіктерін шығарды. Олардың ішінде аномальдық ядродағы хромосомалар саны өзгерген тіршілікке икемсіз өсімдіктермен бірге ол бастапқы хромосомалар саны сақталған, бірақ картоптың солуауруын қоздыратын саңырауқұлақ токсиніне төзімді өсімдіктерді байқады. Кейінірек Д. Шепард кариотипі нормалы 65 протоклонды линиялық белгілерді анықтады. Олардың тіпті күрделі генетикалық белгілері де өзгерген, мысалы, түйнектер өнімі. Сомаклондық өзгергіштік әр түрлерге жататын көптеген өсімдіктерде байқалады.

Сомаклондық өзгергіштіктің себептері. Өсірілетін жасушалардағы қандай да болсын өзгергіштікті тек хромосомалардың саны өзгеруімен, кейде хромосомалардың құрамындағы өзгерістерімен, нүктелік мутацияларымен, цитоплазмалық гендердің өзгерістерімен байланысты деп соңғы кездерге дейін есептеліп келеді.

Хромосомалар құрылысындағы өзгерістер (аберрациялар) тұқым қуалайтын өзгерістері көп, олардың түрлі класы бар, ол генетикалық материалдың бір бөлігінің жойылуын (делецияны), екі еселенуін (дупликацияны), айнымалылы (транслокацияны), 180° айналуына (инверсия) бір хромосома ішінде немесе бірнеше хромосомалар арасында өтеді.

Өсірілетін ұлпаларда хромосомалық аберрациялар өте жиі кездеседі, сондықтан олардың елеулі фенотиптік өзгерістерге әкеліп соғуы әбден мүмкін. Бірақ регенерант өсімдіктер мен түраралық ұрпақтары арасында хромосомалық аберрациялар сирек кездеседі, себебі даму кезінде олар элиминацияға ұшырайды (жойылады). Сомаклондық варианттардың ұрпақтарында ұрықсыздыққа апаратын хромосомалық аберрациялар да болмайды.

Жылжымалы гендік элементтер (транспозондар) хромосома бойымен козғалып, құрылымдық гендерді тежеуі, гендерді реттеу тәртібін өзгертуі, істемей тұрған гендерді активтеуі және дупликациялар мен делецияларды туғызуы мүмкін. Жылжымалы гендік элементтер өздерінің орнын ауыстыру арқылы генетикалық тұрақсыздыққа, мутагенезге және хромосомалардың құрылымының өзгерістеріне әкеліп соғады.

Сомаклондық өзгергіштікке әсер ететін факторлар. In vitro өсіру кезінде пайда болатын өзгергіштіктің молдығына донорлық өсімдіктің генотипі әсер етеді. Мысалы, арпаның хромосомалық аномалиялары, бидайдың, танқурайдың, бегонияның морфологиялық өзгерістерінің жиілігі түрлі сорттарында әр қилы болған. Күріште өзгерістердің пайда болу жиілігі мен олардың әр түрлілігі өсіру жағдайына емес, сорт табиғатына байланысты болған.

Сомаклондық өзгергіштіктің пайда болуы сондай-ақ қоректік ортаның құрамына да байланысты, әсіресе фитогормондарға. Гормондар құрамының өзгеруі жасуша циклінің кинетикасы мен митоздың өзінін де жасушалар мен регенеранттарда өзгеруіне әкеліп соғады. Жасушаларды бүтін өсімдіктен бөліп алып, жасанды ортада өсірудің өзі олардың гормондық балансын өзгерту арқылы өсіру мерзімінің үзақтығы хромосомалық аберрацияларды көбейте түседі. Сондықтан каллустан алынған самоклондык варианттардың жиілігі каллусты өсіру мерзімі қоректік ортаның құрамына қарай арта түседі. Самаклондық өзгергіштікті зерттеу теория түрғысынан генетикалық өзгергіштіктің механизмдерін түсіну үшін манызды. Өсірілетін клеткаларды өсімдік селекциясында кеңінен қолдану үшін қажет. Сомаклондық өзгергіштікті селекция үшін маңызы, ол өсімдіктердің жаңа формаларын будандастыруды қолданбай-ақ генетикалық ауытқушылықты молайту мүмкіншілігі. Шаруашылықтық маңызды белгілері бар күріштің, бидайдың, жүгерінің, қант қамысының, жоңышқаның, картоптын, рапстын, зығырдың сомаклондык варианттары алынған. Сомаклондык варианттардың негізінде апельсин мен шабдалыныңн жаңа сорттары шығарылған.

Қазақстан ғалымдарының зерттеулері нәтижесінде бидай, арпа және жүгерінің мыңдаған регенерант өсімдіктері алынып, түрлі экологиялық аймақтарда селекциялық және генетикалық зерттеулер жүргізу үшін қолданылады. Егіншілік ғылыми-зерттеу институтында сомаклондармен жұмыс істеліп, 200-ге таяу линиялар алынған. Ақмола аграрлық университетінде сомаклондык варианттарды сұрыптау негізінде бидайдың «Кенжеғали» деген сорты шығарылды.

Тақырып 11.Гаплоидтардың селекциядағы манызы.

Мақсаты:Студенттерді тозаңқаптар мен тозаңдарды өсіріп гаплоидтарды алудың алғы шарттарымен, будан ұрықтағы хромосомалардың селективі жойылуы әдісімен гаплоидтарды алу әдістемесімен, гаплоидтык өсімдіктерді аналық гаметофитті өсіру арқылы алу әдісімен, гаплодтардың селекциядағы маңызымен таныстыру.

Жоспар:

1. Гаплоидтарды генетикада және селекцияда пайдалану жолдары.

2.Тозаңқаптар мен тозаңдарды өсіріп гаплоидтарды алу.

3.Гаплоидтардың селекциядағы манызын пайдалану жолдарын.

4.Гаплоидтардың селекциядағы манызы

Гаплоидтық өсімдіктерді осы әдіспен алу үшін қоректік ортаныңн маңызы зор. Көбінесе Мурасиге-Скугтың, Миллердін, Ничтің №6 орталары колданылады. Әсіресе фитогормондардың түрі мен мөлшері үлкен роль атқарады. Кейбір өсімдіктер үшін ауксиндер мен цитокининдер керек болса, басқаларына тек қана ауксиндер қажет.

Фитогормондардын жоғары концентрациялары көбінесе түйіннің сомалық ұлпаларынан каллустың шығуына себеп болған. Бидайдың ұрықтанбаған түйіндерін өсіргенде, эмбриоидогенез өту үшін ең тиімдісі 2,4-Д мен кинетин (6-10 мг/л) қосылған Мурасиге мен Скугтын ортасы болған.

Сондай-ақ витаминдер, казеин гидролизаты, кокос сүті, ашытқы экстракты т.с.с. жағымды әсер етеді. Бірақ олардың мөлшері тәжірибе арқылы іріктеліп алынады. Сонымен бірге көмірсулардың (глюкоза, фруктоза, сахароза) маңызы зор. Астық тұқымдастарының көбі сахарозаның жоғары концентрациясын талап етеді, мысалы, бидай - 8-14 %, арпа - 3-10 %.

Әдетте түйіндер мен тұқым бүршіктерін қатты ортада 23-28°С температурада, жарықта немесе караңғыда өсіреді, бірақ тәжірибе көрсеткендей, күріштің, мақтаның, бидайдың аналық гаметофиттерін сұйық ортада өсіру тиімдірек.

4. Гаплоидтық жасушалар мен протопластар жасушалардың бөлінуі мен дифференциялануың, сомалық жасушалардың генетикасын және популяциялардың генетикасын зерттеу үшін ыңғайлы эксперименттік модель. Гаплоидтық өсімдіктер практикалык селекция мен теориялық зерттеулерде қолданылатын өте құнды генетикалық материал.

Гаплоидтарды пайдаланып, яғни хромосомалар санын екі есе арттырып, гомозиготаларды жылдам алуға болады. Гаплоидтық өсімдіктерді колхицинмен өндесе, хромосомалары мүлде ұқсас гомозиготалық дигаплоидтық организм пайда болады. Гаплоидтар ұрықсыз болады, себебі гомологиялық хромосомалары болмағандықтан мейоз процесі бұзылып, аномальдық хромосомалар жиынтығы бар гаметалар түзіледі. Хромосомалар екі еселену арқылы гаплоидтық өсімдік гомозиготалықк диплоидтық ұрықты өсімдікке айналады.

Әріден будандастыру арқылы алынған будандардың гаплоидтарын шығарып, олардың дигаплоидтарынан тұрақты гомозиготалық сорттарды шығару әсіресе маңызды. Әріден будандастырғанда түраралық, туысаралық, тіпті буданаралык будандастыру нәтижесінде гетерозис құбылысы орын алады. Дигаплоидтарды алу арқылы гетерозисты сақтап қалу өте маңызды. Екі еселенген гаплоидтардың негізінде гетерозистық будандарды алу үшін қажетті изогендік линияларын бір жылдың ішінде шығаруға болады, ал әдеттегідей инбридинг әдісімен бұған 4-6 жыл кетеді. Гаплоидтық өсімдіктерде рецессивтік гендік мутацияларды анықтау оңай, себебі олар доминанттық аллелъдермен бүркелмейді.

Андрогенезді қколдану гаплоидтық селекциямен шектелмейді. Гаплоидтық жасушалардан алынған протопластарын косып будан өсімдіктерді алуға болады. Гаплоидтық протопластардың көзі ретінде тозаңқаптар мен микроспоралардан іп vitroжағдайында пайда болған каллус жасушалары мен басқа андрогендік құрылымдар (глобулалар, эмбриоидтар) болады. Екі гаплоидтық протопласт қосылып, диплоидтық будан клетка түзіледі, одан кейін будан регенерант өсімдік пайда болады.

Сомалық будандардың гаплоидтық протопластардан алынуы генетикалық алуан түрлілікті едәуір кеңейтеді, себебі бұл кезде сомаклондық өзгергіштікпен бірге гаметоклондық өзгергіштік орын алады.

Микроспораларды өсіргенде, оларда мутагенезді тудырып мутант өсімдіктерді шығаруға болады. Өсіріп жаткан микроспораларды түрлі химиялық немесе физикалык мутагендік факторлармен, патотоксиндермен, гербицидтармен, зиянды тұздармен т.б. өңдегенде, олардын көбісі құрып кетеді. Ал сол факторға төзімді азғана микроспоралар тіршілікке икемділігін сақтап қалады. Олар кейін бөлініп андрогендік құрылымдарды және де регенерант өсімдіктерін шығарады. Бұл микроспораларда өткізілетін мутагенез және клеткалык селекция. Елеулі айырмашьшығы, ол алынған регенерант өсімдігі гаплоидтық болғандықтан, мутант өсімдіктер басқалардан оңай ажыратылады. Бұл бағытпен түрлі қолайсыз факторларға, соның ішінде бактериялар мен саңырауқұлақтар қоздыратын ауруларға төзімді өсімдіктердің жана формаларын шығаруға болады.

Тақырып 12.Протопластарды будандастыру, сомалық будандастырудың негіздері.

Мақсаты: Студенттерді протопластарды қосу арқылы будандастырумен, бөліп алумен, протопластардын тіршілікке икемділігін аттыру жолдарымен, олардыы іп vitro-да өсіру тәсілдерімен, протопластардан регенерант өсімдіктер шығару мен және олардың бір-бірімен құйылысып қосылуы мен таныстыру.

Жоспар

1. Протопластарды бөліп алуды.

2. Тіршілікке қабілетті протопластарды алуды.

3. Протопластардын бір-бірімен құйылысып косылуын.

4. Сомалық будандарды сұрыптап алу әдістерін.

Сурет 14. Протопластарды бөліп алу.

Осмотик ретінде сахароза, маннит, сорбит қолданылады. Осы заттардың гипертониялық ерітінділері әсерінен вакуоль сусызданып жиырылып, протопласт көлемі кішірейіп, соңынан қабықтан алшақтайды. Кейде жасуша сопақ болғанда протопласт плазмолиз кезінде екі бөлініп кетуі мүмкін. Сондай ядросы жоқ субпротопласт цитопласт деп аталады.1968 жылы жапон ғалымы Такебе темекі жапырағынын мезофилл жасушаларынан протопластарды көп мөлшерде алудың тиімді әдісін жете зерттеп дайындады. Алдымен жапырақты 70 %-тік этанолда стерильдейді, кейін 15-20 мин 10 %-тік кальций гипохлоритінде ұстап, дистильденген суда шайып алады. Астыңғы эпидермисті алып тастап, жапырақты майда бөліктерге кесіп, пектиназа ферментінің ерітіндісіне салады. Пектиназа жасушааралыққабаттың заттарын ерітеді, яғни мацерация өтеді. Одан кейін объект целлюлаза ферментінін ерітіндісімен өнделеді, бұл кезде целлюлозалықжасушақабығы біржолата жойылады. Ферментерітіндісіне осмостық зат қосылады. Осы әдіспен әр түрлі өсімдіктердіңұлпаларынан протопластар алынады.

Қазіргі уақытта протопластарды бөліп алу үшін ферменттердің қоспасын пайдаланады. Бұл қоспаныңқұрамында ферменттердіңүш түрі болады пектиназалар, целлюлазалар және гемицеллюлазалар. Олар жасушақабығының негізгі компоненттерін ыдыратады.

Ферменттік ерітінділерді арнайы сүзгіден өткізу арқылы залалсыздандырады. Жасуша түрлерінде құрылымы мен құрамы жағынан айырмашылықтары болғандықтан, қолданылатын ферменттердің комбинациялары мен мөлшерінің ара қатынасы бірдей болмайды. Әрбір ұлпа үшін ферменттердің құрамы, концентрациясы мен ара қатынасы және өндеу уақыты бөлек іріктеліп алынады. Бөлініп алынған протопластар ферменттік ерітіндіде мейлінше аз уақыт болуы керек, одан кейін ұқыпты түрде жуылуы қажет.

Протопластарды бөлу кезінде осмостық стабилизатор маңызды қызмет атқарады. Протопластар бүтін болу үшін ферменттік ерітінділер изотониялық немесе гипертониялық күйде болу керек. Кейде материалды алдын ала плазмолиздық ертіндісінде біраз ұстайды. Осмостық зат ретінде көбінесе қанттар (глюкоза, сахароза, сорбит, маннит) пайдаланылады, кейде СаС1₂, Ма₂НРО₄, КСІ тұздардын ерітіндісі 0,3-0,8 М концентрацияда қолданылады. Осмостық заттың дәл концентрациясы өсімдіктің нақтылы түріне және онын физиологиялық күйіне байланысты жеке іріктеліп алынады. Көбінесе ферменттер кейін протопластарды өсіруге қолданылатын қоректік ортада ерітіліп дайындалады. Ферменттікерітіндінің рН көрсеткішін бір деңгейде (5,4-6,2) ұстау үшін буфер қосады.

Протопластарды бөлу кезінде аэрацияның маңызы зор. Сондықтан ортаны араластыратын жабдықтар қолданылады немесе ферменттік ерітінді түбіне ғана құйылған Петри табақшасында бөліп шығарады. Протопластарды ала көленкеде немесе қараңғыда бөліп алады. Ферменттік ерітіндіде инкубация уақыты ферменттердің үйлесуіне, рН және температураға байланысты, 1-2 сағаттан 15-16 сағатқа дейін барады. Әрбір нақтылы ұлпа үшін ең тиімді температурамен өндеу уақытын жеке іріктеп алу қажет. Температура әр деңгейде болады, мысалы бидайға 14°С болса, томатқа ең қолайлысы 27°С.

Протопластар бөлініп алынған сон, олар ұлпаныңқалдықтары мен ферменттерден тазалануы керек. Ол үшін оларды центрифугалайды немесе сүзіп алады. Инкубациялыққоспаны тесіктері 50-100 мкм електен сүзеді, одан кейін протопласт суспензиясын центрифугалайды.

2. Протопластарды нәтижелі бөліп алу көптеген факторларға байланысты. Олар атап айтқанда: ұлпаның шығу тегі (жапырақ, тұқымжарнақ, тамыр, тозаң түйірі, каллус ұлпасы, суспензиядағы жасушалар), өсімдіктің түрі мен сорты, өсімдіктің физиологиялық күйі, ферменттердің құрамы, олардың сапасы, ортаның рН және осмостық заттың түрі.

Протопластардың тіршілікке икемділігін, яғни олардын метаболиттік активтігін анықтайтын арнайы әдіс бар. Ол протопластардын флуоресцеиндиацетатпен (ФДА) боялуы. ФДА - бұл флуоресценциясы жоқ қосылыс, протопластар мембранасы арқылы жеңіл өтеді, тірі протопластардың ішінде эстеразалардың әсерімен ыдырайды. Протопластар суспензиясының сапасы тіршілікке икемді протопластардың санымен (процент мөлшерінде) белгіленеді. Протопластардың саны Фукс-Розенталь камерасында есептеледі. Протопластардың тығыздығы (суспензиянын 1 мл-дегі саны) суспензияның маңызды сипаттамасы. Егер ұлпаның немесе өсірілген жасушалардың ылғалды массасының 1 граммынан 100⁵ тен ІхІО'¹ дейін тіршілікке икемді протопластар шықса, онда протопластар жақсы бөлініп алынды деп есептеледі.

Протопластарды көп мөлшерде тұрақты алып отыру үшін өсімдіктерді белгілі бір жағдайда өсіру керек және олардың ең қолайлы өсу кезеңің нақтылы бір жағдайын анықтап таңдап алу қажет.

Іп vitroөскен жасушалар мен ұлпалардан протопластарды бөліп алудың мынадай өз артықшылықтары бар: стерильдік, іп vitroжағдайында өсуге бейімділік. Бірақ жасуша қабықшасының химиялық құрамының күрделі болып өзгеруі және онын калыңдауы ферменттік гидролизді қиындатады. Бүтін протопластардың бөлініп алынуы өсірген жасушалардың ішінде меристемалық жасушаларының сан жағынан үлесіне сай болады, ал ол үшін суспензиядағы жасушаларды жиі-жиі (әрбір 2-3 тәулігінде) жаңа коректік ортаға көшіріп отыру керек.

Суспензияда өсірген жасушалардан протопластарды алу үшін ең қолайлы мезгіл, ол жасушалардың өсу кезеңінің логарифмдік фазасының соңында. Осы мезгілде жасуша қабықшалары ферменттердің әсерімен оңай ыдырап, өміршең протопластарды береді. Протопластардың тіршілікке икемділігі оларды бөліп алу жағдайлары мен тәсілдеріне байланысты. Жасушаның плазмолиз кезінде сусыздандырылуы және қабығының бұзылуы оны шок күйіне (күйзеліске) душар етеді. Бұл жағдайда цитоплазманың вакуольденуі артады, көптеген липид тамшылары пайда болады, полисомалардың саны азаяды, ядро мен хлоропластар коюланады.

Фермент препаратының сапасы протопластардың бөліп алынған санына, мөлшеріне ғана емес, олардың кейбір қасиеттеріне де әсер етеді. Пектиндер мен целлюлозаларды гидролиздейтін саудалық фермент препараттарына қоспа ретінде протеазалар, липазалар, нуклеазалар және басқа ферменттер, фенолдық қосылыстар, тұздар кіреді. Олар плазмалемманың қасиеттерін өзгертуі мүмкін. Осы токсикалық заттардан құтылу үшін және протопластардың шығуын арттыру үшін ферменттерді тазалауға болады.

3. Протопластарды іп vitroтүрлі тәсілдермен өсіруге болады. Өсіру тәсілі тәжірибенің мақсатына байланысты. Алдымен протопластарды қоректік ортада шайқап жуып ферменттерден тазартады. Сонан соң олардың 1 мл ортадағы санын есептеп алады. Жасайтын тәжірибеге сәйкес олардың тығыздығын керек көрсеткішке жеткізеді. Ол үшін протопластарды әр түрлі көлемі бар ортаға салады. Мысалы, протопластардың тығыздығын асыру үшін оларды аз көлемді ортаға салады. Ал, керісінше, протопластардың тығыздығын азайту үшін оларды қоректік орта мол құйылған ыдысқа көшіреді. Сөйтіп, протопластардың 1 мл ортадағы санын оқтын-оқтын есептеу арқылы олардың тығыздығын істейтін тәжірибеге сайма-сай келтіреді.

Протопластарды сұйық ортада өсіргенде жасушаларды өсірген сияқты олардың тығыздығы жоғары болуы керек. Көбінесе бұл көрсеткіш 1мл 10⁴ - 10⁵ жасуша болады. Егер қоректік орта сұйықталып, протопластар саны бұдан аз болса, онда олар жөнді өсе алмайды. Өте сұйық суспензияда протопластардың ішіндегі тіршілікке қажетті кейбір метаболиттер плазмалемма арқылы ортаға шығып кететін көрінеді.

Протопластардың өсуіне жақсы жағдай жасау үшін «қоректік қабат» әдісін пайдаланады немесе байытылған ортаны қолданады, болмаса олар өсіп жатқан ортаның көлемін минимумға дейін азайтады. «Астыңғы қоректік қабат» ретінде рентген немесе гамма-сәулелері әсер еткен протопластар мен жасушалар пайдаланылады. Сол әсерден ондай жасушалар бөліну қабілетінен айырылады, бірақ басқа жасушалардың өсуіне жағдай туғызады. Осы әдістің тағы бір түрі, ол нашар өсетін протопластарды жақсы өсетін протопластармен бірге өсіру. Байытылған орталар өсімдіктердің шамалы түрлері үшін ғана оң әсерін тигізеді.

Протопластарды өсірудін кең таралған әдісі, оларды жоғары ылғалдылықта көлемі 20-40 мкл тамшыларда өсіру. Петри табақшасының қақпағында немесе түбіндегі кішкене тамшыларға протопластар автоматтық пипеткамен салынады. Протопластарды өсіру үшін бұл әдістің тиімділігі - материалдар мен уақытты үнемдеп, қоректік ортаның мыңдаған варианттарын тексеруге мүмкіншілік береді. Бірақ бұл әдістін де кемшілігі бар, ол протопластардың тамшының ортасына жайылуы.

Протопластарды суспензия ретінде сұйық ортада ғана емес, біраз қоюланған ортада да өсіруге болады. Ол үшін ыдысқа құйылған қоюланған ортаның бетіне жұқа қабат етіп қана протопластарды салады. Бұл әдіс бойынша, сұйық ортамен көлемі тең қоюланған ортада протопластардың концентрациясын екі есе көп етіп өсіруге болады,

Протопластарды агары бар қатты ортада да өсіруге болады. Ол үшін протопластар суспензиясын 1,2 % агары баржылы (45°С) көлемі бірдей ортамен араластырады. Орта суып қаткан соң оның ішіндегі протопластар бір-бірінен алыстау болып бекітіліп орналасып қалады. Осы агарда орнықтыру әдісі протопластардың әрқайсысының өсуін жеке бақылап отыруға мүмкіндік береді. Агар орнына агароза қолданылса, жасушалардың бөлінуін арттыруға болады екен. Агароза агардыңқұрамына кіреді, шамасы агар екі полисахаридтің - агароза мен агаропектин - қоспасы. Бұл тәсіл, әсіресе өсу қарқыны бәсең немесе өспей қалған протопластарға қолайлы.

Жасуша қабығы қайта пайда болып, жасушаның алғашқы бөлінуіүшін қоректік заттар орташа мөлшерде қажет болады. Ортаның концентрациясы жоғары болса, протопластардың күй-жағдайы тіпті нашарлауы мумкін. Ал екі-үш рет бөлінгеннен сон жасушалар қоректік заттардың жетіспеушілігінің зардабын шеге бастайды. Егер осы кезде орта байытылмаса, бөлінуі тежеліп, клеткалар тіпті кұрып кетуі де мүмкін. Өсіру кезінде қоректік ортаны байытудың екі жолы бар: жоғары концентрациялы қойылтылған ортаны тамшылап қосып отыру және қатты қоректік қабатты қолдану.

Протопластарды да жасушалар мен ұлпаларды өсіретін белгілі қоректік орталарда өсіреді. Протопластарды өсіретін қоректік ортаның негізгі айырмашылығы - кальцийдің концентрациясы 2-4 есе артық және 0,4-0,8 М осмостық заттардың қосылуы. Протопластарды өсіру үшін кеңінен қолданылатын қоректік орталар: өзгертілген Мурасиге-Скуг ортасы (көбінесе ол Нагата және Такебе ортасы деп аталады); Гамборгтың В₅ ортасы және Као мен Михайлюктін ортасы (бұл витаминдермен, амин қышкылдарымен және қанттармен, кейде фитогормондардың күрделі құрамымен байытылған Гамборгтын В₅ ортасы). Бұнда қанттар (ксилоза, рибоза, целлобиоза, манноза, рамноза) осмотик ретінде ғана емес, клетка қабығынын тез пайда болуына да әсер етеді.

Протопластарды осіргендегі температура өсімдіктің түріне байланысты 15°С-тан 30°С-қа дейін болады. Әдетте протопластар температураға өте сезімтал. Жарықтың қарқыны 0-ден 2000 люкске дейін болады.

4. Ең бірінші болып 1971 жылы Такебе протопластарды нәтижелі өсіріп, олардан өсімдіктерді шығаруға болатындығын дәлелдеді. Лайықты жағдайда протопластар жасуша қабығын қайта түзіп, кәдімгі нағыз жасушаға айналады. Электрондық микроскоп көрсеткендей, өсімдік протопластарының сыртқы қабатында 10-20 минут өткен сон бірінші целлюлозаның микрофибрильлері пайда болады, ал 20 сағаттан кейін олар қабықтың тығыз торын түзеді. Жасуша қабығының плазмалеммамен байланысының бұзылуы, шамасы, бірден қабықты қайта құру механизмін іске қосады. Ең қызығы, қабығынан айырылмаған плазмолизге ұшыраған протопластың үстінде жаңа қабықтың түзілгені. Қабықтың түзілуінің ерекшеліктері және жылдамдығы бастапқы клетканың түріне және дифференцировкасына байланысты.

Алқа, крестгүлділер, шатыршагүлділер тұқымдастар өсімдіктерінің протопластары жасуша қабығын 24 сағат ішінде түзеді. 24-36 сағаттан кейін жасушалар бірінші рет бөлінеді, ал 3-4 апта өткен сон каллус жасушаларының колониясы түзіледі. Өсіру кезінде біртіндеп (2 аптадан кейін) ортаның осмостық қысымын төмендетеді, соның нәтижесіңде бөліну жылдамдығы өседі. Содан кейін каллустарды регенерация өту үшін қатты ортаға көшіреді. Каллуста морфогенездің (органогенез) басталуы, яғни өркен мен тамырлар түзілуі регенерант өсімдіктер пайда болуына әкеледі.

Талай өсімдіктердін протопластары сомалық эмбриогенез арқылы да регенерант өсімдіктер түзеді. Оқшауланған протопластардан пайда болған жасушалардың бөлінуге және тотипотенттілігін жүзеге асыруға қабілеттері көптеген факторларға тәуелді:

1) бастапқы ұлпаның түр ерекшелігі, физиологиялық күйі және дифференцировкасы, яғни генетикалық және эпигенетикалық сипаттамасы;

2) протопластарды бөліп алу әдістері мен жағдайлары;

3) протопластарды суспензияда өсіргендегі тығыздығы;

4) қоректік ортаның құрамы;

5) протопластарды өсіру жағдайлары.

Сурет 15. Картоптың протопластарын бөліл алу, өсіружәне регенерацияны өткізу схемасы.

Көптеген ауыл шаруашылығына маңызы зор өсімдіктердің жақсы өсетін, ақырында регенерант өсімдік беретін протопластары алынған. Бірақ олардың жасушаларының бөлінуін және дифференциялануын реттейтін факторлар туралы мәліметтер әлі жеткіліксіз. Алқа тұқымдастарына жататын темекінің, шырайгүлдің, картоптың, томаттың протопластарынан регенерант өсімдіктер алу оп-онай, ал астық тұқымдастары мен бұршақ тұқымдастары үшін көпке дейін бұл өте қиын мәселе болып келді.

5. Өсімдіктердің жасушалык инженериясы деген термин кең мағыналы түсінікті қамтиды. Мұның бір мәні - протопластардың бір-бірімен құйылысып қосылуы негізінде жасалатын биотехнологиялық тәсілдер жүйесі. Протопластар құйылысқанда алдымен олар бір-біріне тоғысып жабысады, оны агглютинация деп атайды. Содан кейін олардың мембраналары да қосылып, екі протопластан үлкен бір протопласт пайда болады. Протопластардың құйылысу механизмі түсініксіз, әсіресе мембраналардыңқұйылысуы. Протопластардың өзінен-өзі құйылысуы өте сирек құбылыс, ол екі протопласт арасында плазмодесмалардың кездейсоққалуынан бола алады.

Протопластардың сыртында теріс электр заряды болады, сондықтан олар суспензияда бір-бірінен оқшауланады. Құйылысу үшін оларды алдымен бір-бірімен жанастыру керек, сондықтан плазмалемма зарядын өзгерту қажет. Протопластардыңқұйылысуы үшін химиялық және электрлік әдістері пайдаланылады.

Химиялық әдіс протопластардың құйылысуына жағдай жасайтын, плазмалемманың электрлік зарядын өзгертетін заттарды суспензияға қосуға негізделген. Э. Кокинг томат тамырының меристемасынан алынған протопластарды қосу үшін нитраттарды пайдаланған. Біраққосылған протопластар аз болған және олар жиі зақымданған. Протопластың сыртында теріс зарядты жою үшін сілтілі ортада (рН=10,5) 50мн СаС1₂ колданылған. Мезофилдің протопластарын қосу үшін бұл жағдай қолайлы болған, ал каллустық протопластарға жарамаған. Бұдан басқа, протопластарды бір-бірімен жақындату үшін 60 айналымжылдамдықпен 2-3 мин центрифугалаған. Протопластарды жақындатып, тоғыстырудың тағы бір жолы -протопластар суспензиясын капилляр арқылы өткізу.

Осындай көп ізденістің арқасында тиімді фюзоген (протопластардын құйылысуына жағдай жасайтын зат) табылды, бұл полиэтиленгликоль болды.

Сурет 16.Протопластардың ПЭГ-тін әсері мен құйылысуының кезеңдері.

ПЭГ - суда жақсы еритін полимер, суспензияның осмостық қысымын көтереді. Қосылатын протопластардың суспензиясын алдымен ПЭГ-тың қоюланған (20-30 %) ерітіндісімен өңдегенде протопластар бір-біріне жабысады. 10-15 минуттан кейін Са²⁺ жоғары мөлшерде (100-300 мМ) бар сілтілі (рН 9-11) ерітіндімен ПЭГ-ты суспензиядан шайып шығарады. Сонан соң протопластарды бір-бірімен жабыстырып тұрған мембраналар құйылыса бастайды. Осындай «ПЭГ - сілтілі рН - мөлшері жоғары Са²⁺» әдістемесі қазір дүние жүзінде көптеген лабораторияларда қолданылады.

Осы әдістемемен 10 %-тен астам (тіпті 50%-ке дейін) протопластарды қосуға болады. ПЭГ қосылғанда протопластар дегидратация арқасыңда бір-біріне жабысады (б). Суспензиядағы суды ПЭГ өзіне сініреді, сондықтан қос қабатты мембраналардың үстіңгісі зақымданып, астыңғы жалаң қабаты басқа мембранамен оңай құйылысады ( в). Мүмкін ПЭГ су ортасының полярлығын төмендетеді,соның нәтижесінде мембрананың полярлық және гидрофобтық компоненттері қайта бөлініп, липидтік құрылымдары тұрақталады. ПЭГ-тің әсерімен мембрана көп жерден тесіледі. Протопластар бір-бірімен жабысқан кезде, сол тесіктер арқылы олардың ішіндегі заттар ары-бері өтеді. Протопластар қосылғаннан кейін де, ең бастапқы кезеңде мембраналардағы тесіктер бітелмейді. Протопластар әбден толығымен қосылған сон ғана олардын мембраналары құйылысып жалпы ортақ бір толық плазмалемма будан протопласты қоршайды. Ақырында протопластар дөнгеленіп будан протопласт пайда болады (г).

Бұл әдістін өз кемшіліктері бар, ПЭГ-мен өңдеу нәтижесінде протопластардың көбі зақымданып құриды. Егер екеу емес, одан да көп протопластар қосылса, олар тіршілікке икемсіз келеді.

Электрлік құйылысу әдісі биік (20 % және жоғары) жиілігімен өзіне назар аударады. Бұл әдістің негізінде электр өрісі пайдаланады.

Сурет 17. Электр өріс әсерімен протопластардың құйылысуының кезеңдері

Протопластар суспензиясы екі электродтың арасында орналасады (а). Айнымалы ток диэлектрофорезді қоздырады, протопластар бір-біріне тақалып бір қатарға тізіледі (б). Бұл тізбектер тек электр өрісі болған кезде туады. Оларға қосымша жеке қатты электр импульсін (600 В/см, 10-20 мкс) бергенде, қатты қысылып тұрған плазмалық мембраналарда тесіктер пайда болады да (в), протопластар бір-біріне құйылып кетеді. Басылып бара жатқан айнымалы электр сигналы цитоплазмалар араласып жатқанда, протопластарды біріктіріп ұстап түрады (г). Электр тогын өшірген соң қосылған протопластар дөнгелектенеді (40). Электр өрісінің әсерінен протопластар бөлме температурасында және рН-тың физиологиялық мөлшерінде нәтижелі косылады. Қысқа қатты импульс мембранаға қысым жасап, протопласт плазмалеммалары қосылып тұрған жерде диэлектрлік бұзылуға себеп болады. Өзгеріліп тұрған электр өрісі мембрана белоктарының латеральдік диффузиясына апарады, соның арқасында белоктары жоқ мембрананың учаскелері пайда болады. Сондай кезде қарама-қарсы тұрған протопластар мембраналары әрекеттесуі мүмкін. Мұнда липид молекулаларымен алмасу, липид көпірлері пайда болуы мүмкін, ақырында мембраналар құйылысады. Электр өрісі көмегімен әр түрлі ұлпалардың және өсімдіктер түрлерінің протопластары қосылады.

Жасушалық инженерия әдістеріне протопластарды қосып будандастырудан басқа, клеткалардың жеке бөліктерінен оларды қайта құрастыру да (реконструкция) жатады. Жасушаларға оқшауланған басқа клеткалық органеллаларды (ядро, хлоропластар, митохондриялар) енгізу арқылы генетикалық жүйені қайта құру мүмкіндігі ғалымдардың назарын аударады. Себебі осы әдіспен цитоплазмалық геномда жазылған қасиеттерді бір клеткадан басқа жасушаға ендіріп, құнды өсімдік формаларын шығаруға болады. Мысалы, жоғары активті хлоропластарды енгізуі фотосинтездің қарқындылығын арттырып, өсімдіктің өнімділігін көтереді. Гербицидтерге шыдамдылықты, кейбір ауруларға иммунитетті және токсиндерге реакцияның белгілері хлоропластық ДНК-да жазылады. Ал митохондриялық ДНК-да цитоплазмалық аталық стерильдік белгісі жазылады. Протопластарға сондай белгісі бар митохондрияларды енгізу арқылы өсімдікке осы бағалы қасиетті тән етуге болады.

Тақырып 13. Өсімдік клеткаларының іn vitro жағдайында өзгергіштігі және оны селекцияда колдану.

Мақсаты: Өсімдік жасушалары мен ұлпаларында болатын өзгерістерді анықтап білуі үшін студенттерді табиғаттағы тіршілік формаларымен, өсімдіктер жасушасының жануарлар жасушасынан айырмашылығымен, жасушалардың құрылыс ерекшеліктерімен, жасуша органоидтарының қызметтері және құрылысымен таныстыру.

Жоспар:

1. Өсімдік клеткалары іn vitro өсіргенде болатын өзгерістерді.

2. Жасушалық селекцияның негіздерін, жасушаларды сұрыптауды.

3. Оқшауланған протопластарға негізделген клеткалық инженерия әдісі.

4. Протопластарды бөліп алу. Тіршілікке қабілетті протопластарды алу.

1. Қазіргі кездегі тұжырым бойынша тіршіліктің 2 формасы белгілі:

1. Тіршіліктің жасушасыз формасы - оған вирустар жатады. Вирустар ете кішкентай, тіпті жай микроскоп арқылы көрінбейтін денелер. Олар нуклеин қышқылдарынан және белоктан тұрады. Олардың тіршілігі тек жасушаға енгеннен кейін ғана байқалды, ал өз беттерінше оларда тіршілік құбылыстары байқалмайды. Вирустарды 1892 ж. орыс ғалымы Д.И.Ивановский ашқан.

2. Тіршіліктің жасушалы формасы. Оның 2 түрі белгілі, А) прокариотты жасушалар (бактериялар, көк-жасыл балдырлар) - түйіршіктелген, цитоплазмадан қос қабат мембрана арқылы шектелген, ядросы болмайды түқым қуалаушылық материялы ретінде сақиналанған ДНҚ кездеседі; рибосомадан басқа органоидтары болмайды; мөлшері жағынан өте ұсақ болып келеді 0,1-0,5 мкм; митоз кездеспейді.

а б в

а прокариотгар; б эукариоттык өсімдік жасушасы; в эукариоттық жануар жасушасы;

Сурет 1. Жасуша түрлері

Б) Эукариотты жасушалар-түйіршіктелген, цитоплазмадан қос қабат мембрана арқылы шектелген, ядросы болады; тұқымқуалаушылық материалы ретінде хромосомалар кездеседі, барлық органоидтары болады; жасуша мөлшері біршама ірі болып келеді-15-65 мкм., митоз жолымен бөлінеді. Эукариоттарды бір жасушалы ағзалар жасушасы және көп жа-сушалы ағзалар жасушалары деп жіктейді, Ал, соңғыларын өсімдіктер және жануарлар жасушалары деп бөледі.

Бір жасушалы ағзалардың жасушасы (қарапайымдылар) - өздері бір жасуша болып тұрып, тұтас ағзаға тән қызметтер атқарады: қозғалу, тітіркену, көбею, бөліп шығару, ас қорыту.с.с. Ал көпжасушалы ағзалардың жасушалары белгілі-бір қызмет атқаруға маманданады, оларда әртүрлі белоктар синтезделінеді, мысалы; эпителий ұлпасының жасушаларында-мелонин, бұлшықет жасушаларында-миозин т.б.

Өсімдіктер жасушасының жануарлар жасушасынан ерекшелігі мынадай:

1) жасуша сыртын калың целлюлоза кабығы қаптап тұрады;

2) цитоплазмада пластидтер (хлоропластгар, хромопластгар, лейкопласттар) кездеседі;

3) вакуолялары болады.

Қазіргі деректер бойынша жасушаның негізгі заты болып оның тірі заты -протопласт саналады. Протопласт цитоплазмаға және ядроға жіктеледі. Ол сыртқы ортадан шеткі мембрана - плазмолемма арқылы шектелген. Цитоплазма өз кезегінде гиалоплазмаға (цитоплазманың негізгі заты - матриксы) және органеллаларға жіктелген.

Гиалоплазма2 мембранамен (плазмолемма, тонопласт) шектелген қоймалжың сұйықтық. Ол органикалықжәне бейорганикалық заттардан тұрады. Оның 80-90 пайызын су құрайды. Органикалық заттардың ішінен негізгілері-белок, нуклеин қышқылдары, майлар, көмірсулар, АТФ т.б. Гиалоплазмада органеллалар бытыраңқы орналасады. Органеллалар дегеніміз-жасушада белгілі-бір қызмет атқарып, цитоплазмада тұрақты түрде кездесетін кұрылымдар. Оларға — митохондриялар, Гольджи комплексі, эндоплазмалық тор, пластидтер, рибосомалар, лизосомалар, жасуша орталығы, микроденешіктер, микротүтікшелер т.б.с. жатады.

Эндоплазмалықторды 1945 ж. Портер ашқан. Ол өте ұсақ, тек қана электрондық микроскоп арқылы көруге болатын, қос қабат мембранамен шектелген және тарамданып гиалоплазманы өне бойына торлап тесіп өтіп орналасқан микроарнашықтар мен микроқуыстар жүйесі болып табылады. Оның 2 түрі белгілі: гранулалы немесе кедір-бұдырлы және агранулалы немесе тегіс эндоплазмалық тор. Гранулалы (кедір - бұдыр) эндоплазмалықтордың мембранасына рибосомалар бекінген, ал тегіс эңдоплазмалықторда рибосомалар болмайды. Цитоплазмада, әдетте гранулалы тор агранулалы торға қарағандаәлдеқайдажақсыжетілген. Агранулалы тор кейбір ерекше қызметатқаратын,яғни майлы заттарды көп синтездейтін жасушаларда ғана жақсы жетілген. Гранулалы тордың қызметі-белок синтездеу, жасуша мембраналарын пайда ету орталығы болып саналады. Сол сияқты, ол вакуоля, лизосома, микроденешіктерді де пайда ете алады. Эндоплазмалық арналар арқылы макромолекулалар, иондар тасымалданады. Агранулалы тор липофильдік заттарды синтездеуге қатынасады.

Гольджи комплексін 1878 жылы италян ғалымы Гольджи жануарлар жасушасынан ашқан және соңғы кездерге дейін ол тек жануарлар жасушаларына ғана тән деп келінген. Бірақ, кейінірек ол өсімдіктер жасушаларында да табылған. Сондықтан Гольджи комплексі барлық эукариотты жасушаларға тән органелла болып саналады. Гольджи комплексі өте жұқа, жалпақ, бірінің үстіне бірі орналаскан. 5-20 калташықтардан-диктосомалардан құралған. Әрбір қалташықтың диаметрі 1 мкм, ал қалыңдығы небәрі 20-25 нм болып келеді. Қалташықтардың жиектері тесіліп бірте-бірте торға айналған. Гольджи комплексінің кызметі-полисахаридтерді синтездеу, жинақтау және тасымалдау болып саналады.

Митохондриялар жасушаның міндетті органеллаларының бірі. Оның пішіні түрліше болып келеді: таяқша тәрізді, дөңгелек, сопақша т.с.с, ал мөлшері 0,5-7 мкм тең. Митохондриялар қос кабат мембранамен шектелген. Сыртқы мембранасы тегіс, тұйық, ал ішкі мембранасы митохондрияның ішіне қарай қатпарлар пайда етеді.

Оларды кристер деп атайды. Кристер арасында митохондрияның негізгі заты-матриксі орналасқан. Онда ДНҚ, рибосомалар, белоктар т.б. кездеседі. Митохондриялар органикалық заттарды ыдырату, АТФ синтездеу қызметтерін атқарады.

Рибосомаларды 1955 ж. Палладе ашқан. Ол екі бөлшектен (кіші бөлшегі, үлкен бөлшегі) тұрады. Олар өте ұсақ, тек электрондық микроскоп арқылы көруге болатын органеллалар. Оның мөлшері небәрі 15-35 нм болады. Рибосомалар р-РНК-дан және белоктан тұрады, оның негізгі қызметі белок синтездеуі болып саналады.

Лизосомалар - диаметрі 2 мкм, әртүрлі ферменттерден тұратын көпіршіктер. Олар органикалық заттардың гидролиздену процессіне қатынасады, яғни жасуша ішілік ас қорыту қызметін атқарады.

Жасуша орталығы - жануарлар жасушаларына тән органелла. Ол 2 центриолядан тұрады. Әрбір центриоля диаметрі 150нм, ұзындығы 300-500 нм болып келетін қуыс цилиндр. Оның қабырғасы үш - үштен 9 топқа топтасқан 27 микротүтікшелерден құрылған. Жасуша орталығының қызметі митоздың қалыпты жүруін қамтамасыз ету яғни хроматидалардың ажырасуын қамтамасыз ету болып табылады.

Микротүтікшелер - түрліше болып келетін ұзын түтіктер, оның диаметрі 24 нм тең.

Пластидтер тек өсімдік жасушаларына тән органеллалар. Олардың 3 түрі белгілі: жасыл пластидтер-хлоропластар (Компаретти, 1791 ж.) сары, қызыл пластидтер - хромопластар (Берцелиус 1837 ж.), түссіз пластидтер-лейкопластар (Крюгер, 1854 ж.).

Цитологияның соңғы кездердегі ең маңызды жетістіктеріне мыналарды жатқызуға болады:

1) Цитоплазманың мембраналық құрылыс принциптерін тұжырымдау;

2) Жасушаның ашық биологиялық жүйе екендігін тұжырымдау, яғни заттар, энергия және ақпарат ағындары туралы тұжырымның қалыптасуы;

Цитоплазма және оның органеллалары биологиялық мембраналардан тұрады, оның қызметі, касиеттері сол мембраналарға байланысты болады. Шынында да, цитоплазманың құрғақ затының 90 пайызын биологиялықмембраналар құрайды; гиалоплазма 2 мембранамен (плазмолемма, тонопласт) шектелген; органеллалар да мембраналардаи тұрады.

Биологиялық мембрана өте жұқа, қалындығы небәрі 5-10 нм болып келетін қабықша. 1972 ж. С.Сингер мен Г.Никольсон ұсынған биомембрананың сұйықтық-мозайкалық моделіне сәйкес, ол 2 биополимерден тұрады: белок және липидтер. Липидтер молекуласы биологиялық мембраналардың қаңқасын құрайды, ол екі қабат болып орналасып, сұйық фаза күйінде болады, ал оның бетінде немесе оған еніп, кейде оны түгел тесіп өтіп белок молекулалары орналасқан. Биологиялық мембраналар жартылай өткізгіштік (таңдамалы өткізгіштік) қасиетке ие, оның ұштары үнемі тұйықталған. Биологиялық мембраналардың арқасында жасушада көптеген дербес, тұйық қуыстар (органеллалар) түзіледі. Мембраналардың арқасында осы қуыстарда тек өздеріне ғана тән химиялық құрамы қалыптасып, бір мезгілде түрліше химиялық реакциялардың жүруіне мүмкіндік туады.

Тақырып 14.Сомаклондық варианттардың болуы және себептері.

Жоспар

1. Сомаклондық өзгергіштікке әсер ететін факторларды.

2. Сомалық будандастырудың генетикалық, биохимиялық талдау әдістері

Сомаклондық варианттарды селективтік қоректік ортада жасуша деңгейінде сұрыптап алу өте тиімді. Себебі жасуша денгейінде сұрыптау селекциялыұ жұмыстың көлемін қысқартып, оның тиімділігін арттырады. Өйткені іп vitro өскен миллион жасушаларды талдаудан өткізу, миллион генотипті талдаумен тең. Мұндай жағдайда генетикалық өзгерістері селективтік ортаға жасушалар ғана тіршілікке икемді келеді. Сондай сұрыпталып алынған жасушалар пайдалы қасиеттері тұқым қуалайтын жасушалық линияларға бастама бола алады. Ол жасушалық линиялардан регенерация процесі арқылы әр түрлі стрестік факторларға төзімді өсімдікті сынақтан өткізіп таңдап алуға мүмкіндік туады.

In vitro өсірілген жасушалардың арасынан нақтылы бір селективтік жағдайға сәйкес өзгеріске ұшырап, пайдалы қасиетке ие болған жасушаларды көбейтіп сұрыптап алуды жасушалық селекция дейді. Әрбір жасушадан өсімдік шыға алатын болғандықтан, жасушалық селекцияны қолданып өсімдіктердің жаңа формаларын тез алуға болады. Оларға бастама болған жасуша белгілі бір төтенше факторға төзімді келсе, одан шыққан өсімдікте көбінесе сол қасиетті сақтай алады.

Жасушалық селекцияның артықшылығы мынада: жыл он екі ай маусымға тәуелсіздік және уақыт пен егіс көлемінің үнемделуі, жасушалық популяцияның әрбір жасушасын жеке организм деп теңесе, бір тәжірибенің өзінде-ақ миллиондаған дарақпен айналысуға болады. Ал дала жағдайында ең көп дегенде ғалым мыңдаған ғана өсімдіктермен жұмыс істей алады.

Генетикалық өзгерістері бар каллус жасушаларынан регенерант өсімдіктер шығару процесінде кейбір мутациялар регенеранттарға өтуі мүмкін. Сондыктан көбінесе регенерант өсімдіктердің бастапқы донорлық өсімдіктерден айырмашылықтары болады. Осындай өсімдіктерді сомаклондық варианттар деп атайды. Бұл ауытқулар тіршілік әрекеттерінің қай-қайсысында да шалуы мүмкін. Осынын нәтижесінде бастапқы өсімдіктен морфологиялық белгілері, онтогенез кезендерінің ұзақтығы, өнімділігі, аурулар мен қолайсыз жағдайларға төзімділігі жағынан айырмашьшықтары бар өсімдіктер пайда болады. Сомаклондық өзгергіштік құбылысын генетикалық өзгергіштік деп түсінуге болады. Сонымен сомаклондық варианттар деп іn vitro жасушаларды өсіргенде генетикалық өзгергішттік нәтижесінде пайда болатын, бастапқы өсімдіктен айныған регенерант өсімдіктерді атайды. Регенерант өсімдік сомаклондық мутант екендігін дәлелдеу үшін жыныстық жолмен көбейетін түрлердің регенеранттарын өздігінен тозаңдандырып және тиісті будандастырулар арқылы генетикалық тексеруден өткізу керек. Жыныссыз жолмен көбейетін түрлерде генетикалық өзгерістер мейоз арқылы берілмейді, сондықтан оларды дәлелдейтін жағдайда клондык көбейтудің тым болмаса екі циклінде жаңа белгінің сақталуы.

Сомаклондык варианттар орнына мына терминдер де пайдаланылады: жасушалық варианттар, варианттық линиялар, фенотиптік варианттар. Протопластардан алынған сомаклондықварианттарды протоклондар деп, ал каллустан алынғанда каллустык клондар деп атайды. Фенотиптік варианттарды бірінші байқаған Д. Шепард еді. Олкартоп протопластарынан мыңдаған регенерант өсімдіктерін шығарды. Олардың ішінде аномальдық ядродағы хромосомалар саны өзгерген тіршілікке икемсіз өсімдіктермен бірге ол бастапқы хромосомалар саны сақталған, бірақ картоптың солуауруын қоздыратын саңырауқұлақ токсиніне төзімді өсімдіктерді байқады. Кейінірек Д. Шепард кариотипі нормалы 65 протоклонды линиялық белгілерді анықтады. Олардың тіпті күрделі генетикалық белгілері де өзгерген, мысалы, түйнектер өнімі. Сомаклондық өзгергіштік әр түрлерге жататын көптеген өсімдіктерде байқалады.

Сомаклондық өзгергіштіктің себептері. Өсірілетін жасушалардағы қандай да болсын өзгергіштікті тек хромосомалардың саны өзгеруімен, кейде хромосомалардың құрамындағы өзгерістерімен, нүктелік мутацияларымен, цитоплазмалық гендердің өзгерістерімен байланысты деп соңғы кездерге дейін есептеліп келеді.

Хромосомалар құрылысындағы өзгерістер (аберрациялар) тұқым қуалайтын өзгерістері көп, олардың түрлі класы бар, ол генетикалық материалдың бір бөлігінің жойылуын (делецияны), екі еселенуін (дупликацияны), айнымалылы (транслокацияны), 180° айналуына (инверсия) бір хромосома ішінде немесе бірнеше хромосомалар арасында өтеді.

Өсірілетін ұлпаларда хромосомалық аберрациялар өте жиі кездеседі, сондықтан олардың елеулі фенотиптік өзгерістерге әкеліп соғуы әбден мүмкін. Бірақ регенерант өсімдіктер мен түраралық ұрпақтары арасында хромосомалық аберрациялар сирек кездеседі, себебі даму кезінде олар элиминацияға ұшырайды (жойылады). Сомаклондық варианттардың ұрпақтарында ұрықсыздыққа апаратын хромосомалық аберрациялар да болмайды.

Жылжымалы гендік элементтер (транспозондар) хромосома бойымен козғалып, құрылымдық гендерді тежеуі, гендерді реттеу тәртібін өзгертуі, істемей тұрған гендерді активтеуі және дупликациялар мен делецияларды туғызуы мүмкін. Жылжымалы гендік элементтер өздерінің орнын ауыстыру арқылы генетикалық тұрақсыздыққа, мутагенезге және хромосомалардың құрылымының өзгерістеріне әкеліп соғады.

Сомаклондық өзгергіштікке әсер ететін факторлар. In vitro өсіру кезінде пайда болатын өзгергіштіктің молдығына донорлық өсімдіктің генотипі әсер етеді. Мысалы, арпаның хромосомалық аномалиялары, бидайдың, танқурайдың, бегонияның морфологиялық өзгерістерінің жиілігі түрлі сорттарында әр қилы болған. Күріште өзгерістердің пайда болу жиілігі мен олардың әр түрлілігі өсіру жағдайына емес, сорт табиғатына байланысты болған.

Сомаклондық өзгергіштіктің пайда болуы сондай-ақ қоректік ортаның құрамына да байланысты, әсіресе фитогормондарға. Гормондар құрамының өзгеруі жасуша циклінің кинетикасы мен митоздың өзінін де жасушалар мен регенеранттарда өзгеруіне әкеліп соғады. Жасушаларды бүтін өсімдіктен бөліп алып, жасанды ортада өсірудің өзі олардың гормондық балансын өзгерту арқылы өсіру мерзімінің үзақтығы хромосомалық аберрацияларды көбейте түседі. Сондықтан каллустан алынған самоклондык варианттардың жиілігі каллусты өсіру мерзімі қоректік ортаның құрамына қарай арта түседі. Самаклондық өзгергіштікті зерттеу теория түрғысынан генетикалық өзгергіштіктің механизмдерін түсіну үшін манызды. Өсірілетін клеткаларды өсімдік селекциясында кеңінен қолдану үшін қажет. Сомаклондық өзгергіштікті селекция үшін маңызы, ол өсімдіктердің жаңа формаларын будандастыруды қолданбай-ақ генетикалық ауытқушылықты молайту мүмкіншілігі. Шаруашылықтық маңызды белгілері бар күріштің, бидайдың, жүгерінің, қант қамысының, жоңышқаның, картоптын, рапстын, зығырдың сомаклондык варианттары алынған. Сомаклондык варианттардың негізінде апельсин мен шабдалыныңн жаңа сорттары шығарылған.

Қазақстан ғалымдарының зерттеулері нәтижесінде бидай, арпа және жүгерінің мыңдаған регенерант өсімдіктері алынып, түрлі экологиялық аймақтарда селекциялық және генетикалық зерттеулер жүргізу үшін қолданылады. Егіншілік ғылыми-зерттеу институтында сомаклондармен жұмыс істеліп, 200-ге таяу линиялар алынған. Ақмола аграрлық университетінде сомаклондык варианттарды сұрыптау негізінде бидайдың «Кенжеғали» деген сорты шығарылды.

Тақырып 15.Гендік инженерияда қолданылатын технологиялар және саланың даму болашағы

Мақсаты: Студенттерге гендік инженерияның даму болашағын, белоктардың сапасын жақсартуды, гербицидтерге, патогендер мен зиянкестерге төзімді өсімдіктерді жасауды, стрестік жағдайларға өсімдіктердің төзімділігін арттыруды, фотосинтездің тиімділігін арттыруды үйрету.

Жоспар:

1. Гендік инженерияның әдістемелік негізін және жұмыс кезендерін.

2. Вектор ретінде пайдалануға жарамды заттардың маңыздылығын жұмыс принцптерін.

3. Табиғи жағдайда агробактерия гендерінің өсімдікке енуі

Гендік инженерияның даму болашағы. Өсімдіктер жасушаларына бөтен генетикалық информацияны енгізу мүмкіндігі тәжірибе жүзінде дәлелденген. Осы әдістерді пайдалану негізінде бағалы қасиеттері бар өсімдіктерді шығару үшін болашақта көп үміт күтерлік жол ашылды.

Өсімдіктерге бөтен гендерді тасымалдау жөніндегі деректер 1981 жылдан бері белгілі. Бактериялар, жануарлар және өсімдіктер гендері плазмидалық Т-ДНҚ-ның рестрикциялық бөліктеріне тігіліп, өсімдік геномына нәтижелі тасымалданған. Нәтижесінде гендік инженерия әдістерімен құрастырылған алғашқы өсімдіктер алына бастады. Өсімдіктерге бөтен генді Ті-плазмиданың көмегімен енгізу әрекеттері ең алдымен бактерия гендерін тасымалдаумен байланысты болды. Ол үшін көбінесе антибиотиктерге төзімділікті белгілейтін Е. соlі гендері қолданылды. Бұл гендерді пайдаланудың себебі, олардың өсімдік геномына тіркесуін оңай тексеруге болатындығынан. Бірақ бұл антибиотиктерге төзімділік белгісінің өсімдік үшін ешбір пайдасы жоқ. Турасын айтқанда, бұл бөтен ген нақтылы тасымалданды ма, жоқ па, тек қана соның куәсі ретінде және де егер тасымалданса, онда өзіне тән қызметін атқарып жатқанын көрсету үшін керек. Бұндай селективті маркерлік гендер өсімдіктерге туыстығы жоқ бөтен гендерді тасымалдау кезінде қолданылады.

Өсімдіктер геномын гендік инженерия әдістерімен өзгертіп қайта құру мақсаты екі мәселені шешуге бағытталған. Біріншісі, трансгенозға байланысты негізгі теориялық мәселелерді шешу, ал түбінде өсімдіктердің алдын ала көзделген белгілі қасиеттері бар жаңа варианттарын шығару үшін практикалық селекцияда гендік инженерия әдістерін қолдану.

Өсімдіктердің ауыл шаруашылығында бағаланатын негізгі белгілері, атап айтқанда: өнімділік, тез пісіп-жетілу, сабақпен масақтың ұзындығы, дәндегі белок мөлшері, түрлі стресс факторларға төзімділік. Осындай құнды қасиеттер көпгендік (полигендік) жүйелердің бақылаумен қалыптасады, яғни гендердің күрделі комплекстерінің өзара әр қилы әрекеттесуі арқылы пайда болады. Өкінішке орай, бұндай полигендік белгілерді гендік инженерия әдістерімен бір организмнен басқа организмге көшіріп дарыту әзірше мүмкін емес. Өсімдіктерді жақсартудың ең жарамды амалдары ежелден организмде бар гендерді өзгерту (модификациялау) және гендік инженерия әдістерімен нақтылы бір белгіні кодтайтын жеке бір генді тасымалдау.

Белоктардың сапасын жақсарту. Екпе өсімдіктер дәнінде қор ретінде жинақталатын белоктарды құрамы жағынан бір-біріне жақын гендер кодтайды. Дәннің қор белоктарының түзіліп жинақталуы күрделі де, дәл реттелетін агрономия және экономика тұрғысынан өте маңызды биосинтетикалық процесс.

Бір өсімдіктің қор белогының сапасын жақсарту үшін оған басқа өсімдіктің қор белогының генін енгізу жөнінде алғашқы әрекетті 1983 жылы АҚШ-та Д. Кемп пен Т. Холл істеген. Олар бұршақтың басты қор белогы фазеолин генін Ті-плазмида көмегімен күнбағыстың геномына енгізген еді. Бұл тәжірибенің нәтижесінде «санбин» деген трансгендік өсімдік алынды. «Санбин» әзірше ешқандай іске жарамсыз, ауыл шаруашылығында пайдаланылмайды, бірақ, сонда да, бұл тәжірибенің маңызы өте зор, себебі ол гендік инженерия әдістерін өсімдіктерге қолдануға болатындығына сенім білдіріп, биотехнологияның осы бағытының басталуын жария етті. Күнбағыс клеткаларында фазеолиндік полипептидтер түзілетіндігі иммунологиялық жолмен анықталды. Өте маңызы зор бұл факт әр түрлі тұқымдастарға жататын өсімдіктер арасында гендерді тасымалдауға болатындығын дәлелдеді.

Одан кейін бұршақтың фазеолин гені темекі клеткаларына тасымалданып, регенерант өсімдіктердің барлық ұлпаларында ол геннің экспрессиясы өткен. Бұршақтың пісіп жетілген тұқым жарнағында фазеолин үлесіне жалпы белоктың 25-50 % келеді. Бөтен өсімдіктерде осындай жоғары мөлшерде фазеолин генінің экспрессиясы өтуі үшін онын өзіне тән реттеуіш сигналдары генмен қоса тасымалдануы қажет және онтогенез процесінде экспрессияның бақылануы маңызды екені білінді.

Жүгерінің зеин деген қор белогының гені Т-ДНҚ-ға тігіліп күнбағыс геномына енгізілген. Ол үшін зеин гендері тігілген Ті-плазмидалары бар агробактериялар штамдарын жұқтырып күнбағыстың сабағында ісікті қоздырған. Кейбір ісіктерде зеиндік мРНҚ түзілетіндігі анықталған. Бұл тәжірибе даражарнақты өсімдік генінің қосжарнақты өсімдікте транскрипциясы өтетіндігін дәлелдейді. Бірақ транскрипция өтіп, РНҚ түзілгенмен ген экспрессиясы толығымен жүрмей, трансляция процесі болмаған, яғни жүгерінің зеин белогы күнбағыс ұлпаларында түзілмеген. Сондықтан қор белоктарын кодтайтын гендерді тасымалдау өте күрделі де көбінесе сәтсіз аяқталатын процесс болып тұр.

Гендік инженерияның жеңілірек іске асатын мақсаты, ол бөтен белок гендерін тасымалдамай-ақ, әр өсімдікке тән белоктың амин қышқыл құрамын жақсарту. Көптеген астық тұқымдастарының қор белогында лизин, треонин, триптофан, ал бұршақ тұқымдастарында метионин мен цистеин жетіспейтіндігі мәлім. Белоктың құрамына жетіспейтін амин қышқылдарын қосымша енгізу арқылы белоктың сапасын жақсартуға болады. Дағдылы селекцияның әдістерімен астық тұқымдастарының қор белоктарында лизин мөлшері едәуір көтерілген. Ол үшін проламиндердің (спиртке еритін астық тұқымдастарының қор белоктары) бір бөлігі лизині көп басқа белоктарға ауыстырылды. Бірақ соның салдарында бұл өсімдіктерде дән уақ болып кеткен және жалпы түсімі кеміген. Шамасы, проламиндер дәннің толық болып қалыптасуына қажет шығар, сондықтан оларды басқа белоктармен ауыстыру түсімді төмендетеді. Осы жағдайды ескеріп, өнімділікті төмендетпейтін, бірақ құрамында лизин мен треонин көп белокты дәнді дақылдарда қалыптастыру қажет.

Астық тұқымдас өсімдіктерде лизинді көбейту мәселесін шешудің тағы бір жолы, ол дәнде бос лизиннің (белок құрамына кірмейтін) мөлшерін арттыру. Бұл тәсіл аспартат-киназа (тармақты амин қышқылдарының синтезі жолындағы бірінші фермент) гені бойынша мутанттарды алуға негізделген. Астық тұқымдастардың аспартат-киназа ферменті бос лизин мен метионин әсерімен кері байланыс механизмі арқылы тежеледі, соның салдарынан лизин синтезі бәсендейтін стадия. Сөйтіп, сол тежеулі стадияның әсерін басу үшін аспартат-киназа құрылысын мутация арқылы біраз өзгертіп, ол ферменттің қарқындылығын төмендету керек.

Кез келген өсімдік белогының амин қышқыл құрамын жақсарту үшін, тек ауыстырылмайтын амин қышқылдарынан (мысалы, лизин, треонин, метионин) тұратын бұрын-соңды болмаған, қолдан жасалған табиғатта кездеспейтін полипептидтерді кодтайтын жаңа гендерді пайдалануға болады. Табиғатта болмаған құрамының 80 %-ті ауыстырылмайтын бес амин қышқылынан тұратын полипептидті кодтайтын осындай генді 1986 жылы Джейнс қызметтестерімен химиялық синтез арқылы жасап шығарды. Ті-плазмиданы және Кі-плазмиданы пайдаланып, олар осы жасанды генді темекі клеткаларына енгізіп, химералық регенеранттарды алды. Сол трансгендік өсімдікте жасанды геннің экспрессиясы жүріп, мүлдем жаңа белок түзілетіні анықталды. Соңғы кезде гендік инженерияның метаболиттік инженерия деп аталатын бағыты қарқынды дамып келеді. Бұл бағыттың міндеті - өсімдіктерде оларға тән емес белоктарды синтездеу арқасында түрлі антиденелерді, вакциналарды, интерферондарды т.с.с. пайдалы заттарды өндіру. Метаболиттік инженерия белоктармен қатар өсімдіктегі көмірсулар мен майлардың да құрамына және мөлшеріне әсер ете алады.

Гербицидтерге төзімді өсімдіктерді жасау. Жаңа қарқынды технологиялар бойынша ауыл шаруашылығында гербицидтер кеңінен қолданылады. Қазіргі кезде бұрын қолданылған экологияға қауіпті, сүтқоректілерге улы гербицидтердің орнына жаңа, қауіпсіз гербицидтер пайдаланылады. Бірақ олардың да кемшіліктері бар. Олар арам шөптерді жоюмен қатар екпе өсімдіктердін де өсуін біраз тежейді.

Глифосат, атразиндер, сульфонилмочевина туындылары сияқты тиімділігі жоғары гербицидтерге кейбір арам шөптер төзімді келеді. Мысалы, атразин қолданылатын егістік жерлерде, көптеген өсімдік түрлерінің төзімді биотиптері пайда болады. Қазір осындай төзімділік механизмдері мұқият зерттелуде. Сондағы мақсат - гербицидке төзімділік белгісін гендік инженерия әдісін қолданып екпе өсімдіктерге енгізу. Бұл жұмыстың атқарылу кезеңдері мынадай:

1) өсімдік клеткасында гербицидтер әсер ететін биохимиялық нысанасын анықтау;

2) гербицидтерге төзімді организмдерді сұрыптап, олардың төзімділікті кодтайтын генін бөліп алу;

3) сол гендерді клондап көбейту;

4) төзімділік гендерін екпе өсімдіктерге тасымалдап енгізіп, олардың трансформацияланған өсімдіктердегі қызметін зерттеу.

Әр түрлі химиялық қосылыстарға, соның ішінде гербицидтерге де, төзімділікті қамтамасыз ететін төрт механизм бар:

1) тасымалдаушы (транспорттық);

2) жоюшы (элиминациялау);

3) реттеуші (регуляциялау);

4) жанасушы (контактық).

Транспорттық төзімділік механизмі гербицидтің клеткаға кіруін тежейді. Жоюшы механизмі - жасушаның ішіне кірген заттар жасуша индукциялайтын факторлар әсерімен жойылады, көбінесе ол ыдыратушы ферменттер, немесе улы заттар модификациялану арқасында зиянсыз заттарға айналады. Реттеу механизм - гербицид әсерімен инактивтенетін белок немесе фермент қайтадан қарқынды синтезделе бастайды, соның арқасында қажет метаболиттің орны толады. Контактық механизм - гербицид әсер ететін нысананың (белок немесе фермент) құрылымы өзгертіледі де, гербицид зиян әсер көрсете алмайды.

Гербицидке төзімділік жалғыз бір ғана генмен белгіленеді, яғни моногендік болады. Бұл жағдай осы белгіні басқа өсімдікке рекомбинанттық ДНҚ-ны қолданып енгізу жұмысын жеңілдетеді. Сонымен бірге, гендік инженерия әдістері гербицидтерді ыдыратуын немесе модификациялауын қамтамасыз ететін ферменттердің гендерін де тасымалдау арқасында төзімді өсімдіктерді шығара алады. Ал дағдылы селекцияның әдістері ұзаққа созылады және де тиімділігі өте төмен.

Патогендер мен зиянкестерге төзімді өсімдіктерді жасау. Ауыл шаруашылығына микроб, саңырауқұлақ, вирустық патогендер мен әр түрлі жәндіктердің тигізетін зияны орасан зор. Сондықтан түрлі аурулар мен зиянкестерге төзімді өсімдік сорттарын шығару ауыл шаруашылық биотехнологияның ең бір өзекті міндеті және де гендік инженерияны практикада қолдану жолындағы үздік мәселе болып табылады. Өкінішке орай, түрлі патогендерге өсімдіктің төзімділігі көптеген гендермен белгіленеді. Бір мезгілде бірнеше локустарды тасымалдау мәселесін гендік инженерия әдістерімен шешу қиын, ал дағдылы селекция әдістеріменен де тіпті мүмкін емес. Қазір гендік инженерияның айлалы әрекеттерімен тек қана жалғыз бір ген немесе хромосоманың бір бөлігінде жалғаса орналасқан бір топ гендер ғана белгілейтін төзімділік белгісін тасымалдап өсімдікке дарытуға болады.

Гендік инженерия әдістерінің тағы да бір іске асатын жолы бар. Кейде өсімдіктің өзіне тән табиғи төзімділік гені болса да, ол патогенге төтеп бере алмайды. Мұндай төзімсіздік гендердің экспрессиясы әлсіз болғандығына немесе гендердің қызмет қарқыны бәсендеуіне байланысты болады. Соның салдарынан патогендік организмдер ауру туғызып өсімдікті күйзеліске ұшыратады. Гендік инженерия тәсілімен төзімділік қасиетін кодтайтын бұл гендердің экспрессиясын реттеуіш элементтерін алмастыру және күшті промоторды енгізу арқылы арттыруға болады немесе гендердің санын көбейтуге болады (амплификация). Бірқатар жағдайларда бұл жол өсімдікке бөтен құрылымдық гендерді енгізумен салыстырғанда оңай және тиімді болады. Себебі, тасымалданған бөтен гендердің өнімдері кей кездерде клеткаға жағымсыз, тіпті зиянды болып шығуы мүмкін.

Фитовирусологияда индукцияланған айқас төзімділік деген құбылыс белгілі. Бұл құбылыстың мәні мынадай. Егер өсімдікке вирустың бір штамын жұқтырса, ондай өсімдік сол вирустың басқа штамдарына да төзімді болады. Бұл құбылыстың молекулалық механизмі әлі анықталмаған. Өсімдікте иммунитет пайда болу үшін оған вирустың өзін емес, тіпті жеке гендерін, мысалы капсида белоктарының гендерін енгізу жеткілікті екен. Темекі теңбіл вирусының қабықша белогының генін темекі клеткаларына тасымалдап, трансгендік өсімдіктер алынған. Олардың жапырағында жалпы белоктардың 0,1% вирус белогы болған. Бұл өсімдіктердің көбі вируспен зақымданбаған. Шамасы, өсімдік клеткаларында синтезделетін вирус қабығы өзгертілген белогы мен вирустык РНҚ қосыла алмайды. Сол себептен вирустар көбеймейді.

Темекі, томат, картоп, қияр, бұрыш трансгендік өсімдіктерінде теңбіл ауруын қоздыратын вирус штамының капсида белогының экспрессиясы оларға басқа штамның инфекциясын жұқтырмайды. Бұл өсімдіктердің ұрықтануы төмендемеген, өсу және физиология процестері өзгермеген. Өсімдіктерді зиянкес жәндіктерденкорғау үшін химиялық заттар - инсектицидтер қолданылады. Бірақ олар сүтқоректілерге де зиян келтіреді, пайдалы жәндіктерді өлтіреді, қоршаған ортаны ластайды, бағасы қымбат болады, және де зиянкестер оларға тез бейімделіп кетеді. Пайдаланатын инсектицидтерге төзімділік қасиеті бар 400 астам жәндіктер түрлері белгілі. Сондықтан биологиялық жолмен күресу амалдары өзіне назар аударуда, өйткені олар әр жәндік түріне сәйкес қатаң таңдаулы әсер етеді және де зиянкестер биопестицидке бейімделе алмайды.

Бұл бағытта әсіресе қызықтыратын микробиологиялық пестицидтер. Олар зиянкестерді өлтіретін микроб токсиндері. Мысалы, Васilus thuringiensis микробының токсині жапырақтармен қоректенетін жәндіктердің личинкасын өлтіреді. В. thuringiensis штамдары бірнеше токсиндерді түзеді. Олар зақымдайтын жәндіктер түріне және де тиімділігіне қарай ерекшеленеді. Қазір 20-ға жакын токсиндер белгілі. Түрлі штамдар токсиндерінің гендері клонданған, олардың нуклеотидтік тізбегі анықталған және ол гендер микроорганизмдердің басқа түрлеріне, мысалы, Pseudomonas fluorescens клеткаларына енгізілген. Бұл кең таралған зиянсыз эпифиттік микроб, көптеген екпе өсімдіктердің нормалы микрофлорасына жатады, соның ішінде тамыр жүйесіне де. Тәжірибелер көрсеткендей, токсин түзетін Рs. fluorescens трансгендік жасушалары бірқатар өсімдіктерді зиянкестерден қорғай алатын қабілетке жеткен.

Осы токсиннің генін өсімдікке тікелей енгізу әрекеттері істелген. Токсинді синтездейтін темекі трансгендік өсімдіктері алынған. Бұл өсімдіктер Моnduca sexta деген зиянкес жәндіктің гусеницаларына төзімді болған. Үш тәулік бойы бұл трансгендік өсімдік жапырағымен қоректенген гусеницалар уланып қырылған. Токсинді түзуші ген және оның арқасында пайда болған төзімділік қабілет доминанттық белгі ретінде тұқым қуалаған.

Вирустар коздыратын аурулар жәндіктер арасында да кен таралған, сондықтан зиянкестермен күресу үшін олардын табиғи вирустарын колдануға болады. Олардан өндірілген препараттарды вирустык пестицидтер деп атайды. Олардың ядохимикаттардан көп артықшылыктары бар: санаулы белгілі бір жәндіктерге ғана әсер етеді; пайдалы жәндіктерді өлтірмейді; қоршаған ортада тез ыдырайды да өсімдіктер мен жануарларға зиян келтірмейді.

Стрестік жағдайларға өсімдіктердің төзімділігін арттыру. Өсімдіктер қоршаған ортаның көптеген қолайсыз факторларының әсеріне тап болады. Олар жоғары және төмен температура, ылғалдың жетіспеушілігі (құрғақшылық), топырақтың тұздануы (сор топырақ), ауаның газдануы, минералдық заттардың жетіспеушілігі немесе керісінше шектен тыс көбеюі т.с.с. Бұл факторлар өте көп болғандықтан олардан қорғану жолдары да әр түрлі - физиологиялық қасиеттерден құрылымдық өзгерістерге дейін. Өсімдіктің қандай болмасын стресс факторына төзімділігі көптеген гендерге байланысты. Сондықтан, өсімдіктің бір түрінен екінші түріне барлық төзімділік белгілерін толығымен тасымалдап енгізу тек қана гендік инженерия әдістерімен әрине мүмкін емес. Бірақ, сонда да, кейбір жағдайда гендік инженерия арқылы өсімдіктердің төзімділігін арттыруға болады. Мысалы, стресс жағдайларына өсімдіктің метаболиттік реакциясын бақылайтын жеке гендермен әрекеттер жүргізуге жағдай бар. Ортаның жағдайларына жауап реакцияларының физиологиялық, биохимиялық, генетикалық негіздерін одан әрі зерттеулер гендік инженерия әдістерін қолданып төзімді өсімдіктерді шығаруға мүмкіндік береді.

Биологиялык молекулалык азотты сіңірудің тиімділігін арттыру. Азот өсімдіктер үшін ең тапшы элемент. Көптеген, тіпті экономика жағынан дамыған елдердін өзінде, химия өнеркәсібі ауыл шаруашылығының азоттық тыңайтқыштарға деген қажетін қанағаттандыра алмайды. Азоттық тыңайтқыштарды шығару процесі өте қымбат және де қоршаған ортаға теріс әсер етеді. Өсімдіктер топыраққа ендірген тыңайтқыштың тек 40-50% ғанасіңіреді, қалғаны суаттарға, жер астындағы суларға еріп түсіп, оларды ластайды. Сондықтан биологиялық азотты сіңіру процесін зерттеу ерекше маңызды мәселе.

Молекулалық азот инертті газ ретінде ауаның құрамына кіреді (75,6 %). Осы ауадағы азотты сініруге қабілеті бар организмдердің биохимия, физиология және генетикасы әжептәуір зерттелді. Мысалы, молекулалық азоттын тотықсызданып аммонийге айналуына жауапты нитрогеназа ферменті жақсы зерттелген. Нитрогеназаның құрылымы молекулалық азотты сіңіре алатын барлық организмдерде бірдей. Азотты сініру процесіндегі міндетті физиологиялық шарт, ол нитрогеназаны оттегінен сақтау, әйтпесе бұл фермент тотығып бүлінеді. Нитрогеназа тек анаэробтық жағдайда ғана өзіне тән қызметін атқара алады.

Азотфиксаторлардың арасында ең жақсы зерттелгендер, бұршақ тұқымдас өсімдіктермен симбиоз түзетін ризобия бактериялары және бос жекеше тіршілік ететін бактерия. Осы бактерияларда молекулалық азотты сіңіру процесіне 17 ген жауапты екен. Гендік инженерия әдістерін мына іске асатындай міндеттерді орындау үшін пайдалануға болады: 1) ризобияларды бұршақ тектес өсімдіктерді отарлау қабілетін арттыру; 2) генетикалық механизмге ықпал жасап, азоттың фиксациясы мен ассимиляциясының тиімділігін арттыру; 3) микроорганизмдерге гендер енгізіп, оларды молекулалық азотты сіңіру қабілетін арттыру; 4) симбиоздық қарым-қатынасты бұршақ тұқымдас өсімдіктерден басқа өсімдіктерге дарыту.

Гендік инженериянын биологиялык азотфиксацияның тиімділігін арттыру саласындағы ен маңызды міндеті, ол молекулалык азотты сініру және отарлау кабілеттері арттырылған ризобиялардың штамдарын шығару. Табиғатта ризобиялар бұршак өсімдіктерін өте баяу отарлайды, тек бірлі-жарымы ғана түйнектер түзеді. Оның себебі мынада, өсімдікке ризобия енетін жері өте кішкентай, ол тамырдың өсу нүктесімен оған жақын өсіп келе жатқан тамыр түтігінің ғана арасы. Тамырдың басқа барлык жері және тамыр түтіктері отарлау мекені бола алмайды. Сонымен қатар, түзілген түйнектердің кейбіреулері молекулалық азотты сіңіре алмайды. Ол өсімдіктердің гендеріне байланысты. Ондай бес ген белгіленген, олардың екеуі рецессивтік гендер. Бұлар қолайсыз үйлескенде, осындай құбылыс байқалады.

Генетика мен селекцияның дағдылы әдістерін пайдаланып отарлау қабілеті өскен ризобиялардың лабораториялық штамдары алынған. Бірақ егістік жағдайында жергілікті жабайы штамдар олармен бәсекелеседі. Сол бәсекеде артып түсу қабілетін арттыру үшін гендік инженерия әдістерін колдануға болады.

Фотосинтездін тиімділігін арттыру. Соңғы кезде жаңа сорттар мен будандардың өнімділігі бірнеше жолдармен арттырылып келеді:

1) өсімдіктің құрылымын генетикалық жетілдіру арқасында;

2) жапырақ көлемін ұлғайту арқылы;

3) өсімдіктің өнім беруші мүшелері массасы мен вегетативтік массасының өзара қатынасын өзгерту арқылы;

4) қор сақтайтын мүшелерде ассимиляттардың жинақталуын арттыру арқылы.

Өсімдіктердің өнімділігін фотосинтез аппаратын реттеп басқару арқылы жүзеге асады. Фотосинтез аппаратының активтігін арттыру жолынын бірі, ол көміртегін сіңіру процесінін генетикалық негізін өзгерту.

С₄-өсімдіктері өздерінің өсу қарқындылығымен және фотосинтездің қарқындылығымен сипатталады. Оларда фототынысалу процесі байқалмайды. Ал көптеген ауыл шаруашылық өсімдіктері С₃-өсімдіктері тобына жатады. Оларда жарықта тынысалу процесі жақсы өтеді. Фотосинтез бен тынысалу процестері өзара тығыз байланысты. Олардың негізінде ең бір маңызды ферменттің-рибулозобисфосфаткарбоксилазаның (РуБФК) екі функциясы жатады: карбоксилаза (СО₂ қосу) және оксигеназа (О₂ қосу) функциялары. Оттегі қосылғанда фосфогликолат пайда болады, ол фототынысалудың негізгі субстраты. Фототынысалу нәтижесінде өсімдік СО₂ сініру орнына оны сыртқа шығарады да соның салдарынан өзінің өнімділігін төмендетеді. С₄-өсімдіктерінде РуБФК оксигеназалық активтігі төмен және де пайда болған СО₂ олар қайтадан сініре алады.

Сондықтан гендік инженерия алдындағы бір міндет ол карбоксилаза активтігі артатын РуБФК ферментін жасау. РуБФК өте күрделі фермент. Ол 8 үлкен және 8 кіші бөлшектерден тұрады. Үлкен бөлшек белогын хлоропластық геном кодтайды және онын синтезі хлоропластық рибосомаларда өтеді. Кіші бөлшектер белогын ядролық геном кодтайды, оның синтезі цитоплазмалык рибосомаларда жүреді. Кіші бөлшектердің полипептидтік құрамына байланысты, ферменттің каброксилазалық/ оксигеназалық өзара қатынасы белгіленеді. Мысалы, темекінің әр түрлерінде бұл қатынас 6-дан 12-ге дейін өзгереді. С₃-өсімдіктерінде бұл қатынас жалпы алғанда 5-7 болады, ал С₄-өсімдіктерінде 13-15 болады.