Тақырып 8. Прогамдық және постгамдық сәйкессіздікті іn vitro жағдайында жеңу.

Мақсаты: Студенттерге прогамдық сəйкессіздік, яғни ұрықтанудың басталмауын, in vitro жағдайында ұрықтандыру процесін жүргізу негіздерін, ұрықгарды іn vitro жағдайында өсірудің қажеттілігін таныстыру.

Жоспар

1. Прогамдық сәйкессіздік, яғни ұрықтанудың басталмауы.

2. Іn vitro жағдайындаұрықтандыру. Ұрықтарды іn vitroөсіру.

3. Пісіп жетілмей жатып бөлініп алынған будан ұрықтарды табысты өсіру.

4. Ұрықты in vitrо өсіру әдісітері. Эмбриологияның теориялық мәселелерін зерттеу.

1. Дүние жүзінде маңызды ауыл шаруашылығы дақылдарының генофонды барған сайын азайып, тозып бара жатыр. Жалпы алғанда, қазір кен көлемде егілетін суперсорттардың саны онша көп емес. Және де олар көбінесе сортаралық будандастыру арқылы шығарылған. Сондықтан олардың генотиптері бір-бірімен тетелес келеді. Жаңа пайдалы қасиеттерді олардың бойына дарыту мүмкіншілігі азайуда. Мұндай жағдайда әріден будандастырудың маңызы артады. Селекция мен генетикада әріден будандастыру ерекше орын алады. Екпе дақылдардын генофондың байытуда басқа әдістерге карағанда бұл әдістің маңызы өте зор. Әріден будандастыру, әсіресе мәдени мен жабайы өсетін түрлерді будандастыру пайдалы. Бар сорттарды жақсартып, олар өсетін ареалды кеңейтіп қана қоймай, мүлде жаңа жоғары өнімді сорттарды, тіпті өсімдіктердің жаңа түрлерін шығаруға мүмкіншілік туғызады. Бірақ өкінішке орай, зерттеуші әріден будандастыруды жүргізгенде прогамдық және постгамдық сәйкессіздік кедергі келтіреді.

Прогамдық сәйкессіздік, яғни ұрықтанудың басталмауы. Бұл жағдайда будандастыруға алынған аналық пен аталық парлар арасында ұрықтану процесі жүрмейді. Оның бірнеше себептері болады:

1) тозанның тіршілік мерзімінің қысқалығы;

2) аталық және аналық гаметалардың дамып жетілетін уақыттарының сәйкес келмеуі;

3) аналық мойны мен тозан түтігінің ұзындықтарының бірдей еместігі;

4)тозанның өнуге қабілеті болмауынан немесе тозан түтігінің өсуінін тоқтап қалуынан оның ішіндегі спермийлер ұрык калтасына жете алмайды;

5) аталық гаметанын жұмыртқа клеткасымен қосылмауы.

Парлардың генетикалық сәйкессіздігі аналық аузы, мойны және тұқым бүршігі денгейінде байқалады.

Көрсетілгендей, сыйымсыздык гендері тозандану, тозан түтіктерінін өсу, ұрыктану және тұқымның даму мерзімдерінде активтелінеді. Бірталай будандық комбинацияларында, әсіресе арпаны түраралық будандастырғанда, өсіп келе жатқан будан ұрықтың клеткаларында генетикалык себептер ата-аналық бір түрдің хромосомалары жойылады (элиминация). Бұл құбылыс Hordeum vulgre мен Н.bulbosum сорттарын будандастырып гаплоид алу үшін кең пайдаланылады. Прогамдық сыйымсыздықтың жоғарыда аталған себептерінін кейбіреулерін ұрыктандыруды іn vitro жағдайында өткізіп женуге болады.

Постгамдық сәйкессіздік - ұрықтану процесі өткеннен кейінгі пайда болған будан ұрық пен оны қоршап тұрған ұлпалардың генетикалық сәйкессіздігі. Осындай сәйкессіздікұүрық дамуының (эмбриогенез) қандай да болмасын кезеңдерінде орын алуы мүмкін. (Еске салу: тозаң түтікшесі арқылы ұрық қалтасына енген екі спермийдің бірі жыныс клеткасымен косылып, зигота пайда болады, одан ұрық дамиды, ал басқа спермий екі ядросы бар орталық клеткамен қосылып, одан эндосперм дамиды. Сондыктан ұрық диплоидтык, ал эндосперм үш плоидтык болады. Осы процесс қосарлы ұрыктану деп аталады. Бұл барлық жоғарғы сатыдағы гүлді өсімдіктерге тән заңдылық. Бұл заңдылықты 1898 жылы С.Г. Навашин ашқан).

Әріден будандастыру кезінде постгамдық сәйкессіздіктін кесірінен ұрық пайда бола алмайды, ал кейде пайда болғаннын өзінде де жөнді дамымайды. Осындай сәйкессіздіктін бірнеше себебі бар: 1) екі спермийдің бірі мен бірі жабысып, олардың ажырамауы; 2) спермийдің жұмыртқа клеткасымен қосылмауы; 3) спермийдің орталық клеткаға қосылмауы, сөйткеннің өзінде де эндоспермнің өте баяу дамуы; 4) эндосперм мен ұрықгың жүғымсыздығы (эндосперм ұрықтың дамуын тежейтін заттар бөліп шығаруы ықтимал); 5) әлі зерттеліп аныкгалмаған беймәлім құбылыстар.

Жиі кездесетін постгамдық сәйкессіздік эндосперм мен ұрықтың қарым-қатынасына байланысты. Эндосперм дамып келе жатқан ұрық үшін қоректік және реттеуші заттардың қайнар көзі. Сондықтан эндоспермнін түзілуі бүзылса, ұрыктын даму шапшандығы тежеледі. Әсіресе бұл ұрық дифференцияланған кезде қатерлі жағдай. Соның салдарынан ұрыктың дамуы киындайды, ол кішірейіп, тіпті жойьшып кетеді. Сонымен бірге ұрыктын құрылысында түрлі ауытқулық пайда болып, ұрығы жетілмеген сапасы кем, өну кабілеті нашар немесе тіпті өне алмайтын тұқым қалыптасады. Будан ұрыктың өсуі мен дамуының тежелуі немесе жөнді жүрмеуі аналық өсімдіктің ұлпасындағы кейбір заттардың ұрықтың қоректенуіне жарамсыздығына байланысты болуы мүмкін. Кейде будан тұқым өніп, өскін шыққанда оның клеткаларының құрамындағы кейбір хромосомалары жойылып, химера өсімдіктер пайда болатын жағдайлар кездеседі. Будан өсімдіктердің одан кейінгі онтогенез кезеңдерінде дамуының ауытқуы да болады, оның себебі будан некрозының, хлороздың, әлсіздіктін, ергежейліліктін гендерінің қызметіне байланысты болуы мүмкін. Мейозды реттейтін гендердің өзгеруі жыныс клеткаларының әдеттегідей дамуынын токтауына апарып соғады. Соның салдарынан будандардың ұрық бергіштік касиеті (фертильность) шектеледі. Постгамдық сыйымсыздықты жеңу үшін будан ұрыкгы in vitro жағдайында өсіреді. Өсімдіктерді әріден будандастыруда іn vitro жағдайында пайдаланылатын әдістерінін ең кен қолданылатыны, ол осы будан ұрықты өсіру әдісі.

2. Іn vitroжағдайында тозанды, тұқым бүршіктерін және түйіндерді өсіру әдістерінің жетілуі арқасында тозаң мен ұрықталмаған тұқым бүршігін бірге өсіріп прогамдық сыйымсыздықты женетін жолы табылды. Іn vitro жағдайында өткізетін тозандандыру мынадай кедергілерден өтуге мүмкіншілік туғызады: 1) тозаңның аналық мойынның жоғарғы бөлігінде өсе алмауы; 2) тозан түтіктерінің өте ұзын аналық мойны арқылы тұқым бүршікке жете алмауы; 3) тозаң түтіктерінін өте баяу өсуі немесе олардың аналық мойында жарылып кетуі. Тұқым бүршікті іn vitro өсіргенде ұрықтанудың мүмкіншілігі аналық мойынды алып тастаса, арта түседі. Тозандандырудан бастап будан тұкым өсіп шыққанша барлық процестер іn vitro жағдайында өтеді.

Бұл салада үнді ғалымдарының қосқан үлесі зор. Бірінші болып 1958 жылы атақты эмбриолог С.Махешвари көкнәрдің ұрыктанған тұқым бүршігін іn vitro жағдайында өсіріп, одаң пісіп жетілген тұқым алған. Содан кейін ол көкнәр мен темекінің бүрбүртігі (плацента) бар және бүрбүртігі жоқ тұқым бүршіктерін іn vitro тозандандыру әдісін жете зерттеп дайындады.

Мойынды, түйін ұшын немесе тікелей түйіннін өзін іn vitro тозандандыру әдісі нормалы тұқымның түзілуіне жеткізеді. Осылай тіршілікке икемді томат, темекі, түйебүршақ, қауьш, кияр, бүлдіргеннің будан тұқымдары алынған. Айқас және өздігінен тозаңданатын өсімдіктерінің гүл шанақгарын ашылуға бір күн калғанда кесіп алып, оларды залалсыздандырып, аналықгы бөліп алады. Аналытың мойның қысқартып немесе толық кесіп тастап, түйінді қоректік ортаға отырғызады. 2-3 күн өткен соң, мойын кесіндісіне немесе түйіннің жанына агарға стерильденген тозанды себеді, ол өсе келе микропиле арқылы ұрык қалтасына енеді. Ұрықтың дамуы іn vitro жағдайында іn vitroсиякты әдеттегідей өтеді.

Бұл процедураны жеңілдету жолы бар, ол үшін тұқым бүршігін бүрбүртігімен бірге өсіріп, сонан соң тозандандыру. Бұнда тұқым бүршігі мен тозан жасанды қоректік ортада ганецей ұлпаларының теріс әсерін сезбейді. Өзара сыйымсыздығы бар өсімдік түрлерін тозандандыру үшін тек осы әдіс жарайды. Мысалы, шырайгүлді екі жолмен тозандандыруға болады. Тозанды аналық мойынның үстіне себеді немесе түйінге тікелей себеді. Осы екі әдіс салыстырмалы зерттелді. Нәтиже көрсеткендей, бірінші жолы тозан түтігінің тұқым бүршігіне дейін өтетін жолы ұзын болса, табысты ұрықтандырудың мүмкіндігі артады.

Бүрбүртігі бар түйінді ұрықтандыру әдісінің де өз артықшылығы бар. Бұл кезде ұрық тыныштық кезеніне душар болмайды, одан өскіндер жедел пайда болады. Демек, будан өсімдікті алу мерзімі қысқарады. Осы әдіспен темекінің түраралық будандары алынған. Іn vitro тозандандыру түйіндерінде көптеген тұкым бүршіктері бар көкнәр, қалампыр, алка тұқымдастар (темекі, шырайгүл) өсімдіктерінде сәтті өтеді.

Іn vitro ұрыктандыру әдісі генетика мен селекцияның теориялык мәселелерін шешуден баска, тозанның және ұрықтандырудың физиологиясын зерттеу үшін қолданылады.

3. Бірінші рет 1925 ж. Ф. Лайбах сібір зығыры мен австриялықк зығырдың әдетте ұрпақсыз буданының жас ұрықтарып іn vitroөсіріп, тіршілік қасиетіне ие өсімдік алған. Содан бастап ұрықты өсіру әдісі түраралық және туысаралық будандардын тіршілікке икемді ұрыктарын сақтап қалу үшін қолданылып келеді. Бұл тіпті постгамдық сыйымсыздықты жеңетін таптырмайтын әдіс болып кетті. Осы әдіспен көптеген түраралық (арпа мен бидай, арпа мен қара бидай, диплоидтық және үшплоидтық күріш сорттары) будандар алынды.

Дағдыдағыдай, будан ұрықтардың ерте мерт болуы олардың клеткаларындағы өзгерістермен ғана шектелмейді, оларға аномальдық дамып келе жаткан эндосперм мен ұрық калтасын қоршаған гинецей үлпаларынын теріс әсері тиеді. Сондыктан оларды мезгілінде бөліп алып, іп үііго жағдайында өсіріп аман сақтап қалуға болады. Пісіп жетілмеген ұрықтарды іп үііго жағдайында нәтижелі өсіру көп факторлармен, ең алдымен оның даму кезеңімен, дифференцияланған денгейімен байланысты. Дифферениияланудан өткен ұрықтарды өсіру онайға түседі.

Астық дақылдарының ұрығын табысты өсіру үшін оларда жетілген дәнжарнағы болуы керек, өйтпесе өркен мен сабақ бастамаларының қалыптасуы тежеледі. Мысалы, арпа ұрығы глобулалық кезеңнен дифференциялану кезеңіне тозанданғаннан кейін 5 тәуліктен сон өтеді. Оның дәнжарнағы 10-шы тәулікке қарай қалыптасады, бұл кезде ұрықтын ұзындығы 0,45 мм шамасы. Будан ұрыктарында даму процесі бәсен жүреді, әсіресе көзге көрінетін морфологиялық дифференциялану басталғанша. Бұл кезде олардың құрылымында аномалиялар пайда болуы мүмкін.

Ұрықтарды бөліп алу мерзімін алғашқы донор өсімдіктердің генотиптеріне байланысты белгілейді. Будан ұрықтардың даму денгейін және будандастыру өткізілген жағдайларды ескере отырьш, астық тұқымдастары ұрықтарының ең өтпелі кезені, ол тозанданудан кейінгі екінші декадасы (он күндік) екені белгілі болды.

Дифференцияланбаған (өзіне тән ұлпалары тузіліп аякталмаған) ұрықтарды өсіру қиынға соғады. Оның басты себебі жасанды қоректік ортаның құрамына қосылатын гормондық факторлар эндоспермнің табиғи жағдайда түзетін гормондық заттарындай болмауында. Сондықтан іn vitroжағдайында ұрықтың дұрыс дамуы үшін жасанды қоректік ортаның құрамын әр өсімдіктің түріне сәйкес ылғи да толықтырып өндеу қажет болады. Ұрық пен эндосперм арасындағы тығыз байланыстын болуы, әсіресе эмбриогенездің бастапқы кезенінде, ұрықтарды іn vitro жағдайында өсіргендё айқындалады. Жаңа ғана түзіліп келе жатқан эндосперм мен әбден дамып жетілген эндоспермнің гормондық құрамдарының арасында көп айырмашылық бар. Егер жас эндосперм ұрықтын дифференциялдануына себепші болса, пісіп жетілген эндосперм бұл процесті едәуір тежейді. Солай болғандықтан, жетілмеген ұрыктар қоректік ортаның құрамын талғағыш, өте «сезімтал» келеді. Сондықтан қоректік ортаға физиологиялық активтілігі жоғары заттар қосылады. Сонымен қатар, жас эндоспермдердін экстракттары да пайдаланылады, мысалы, кокос жаңғағынын, жүгерінін, каштаннын т.б. өсімдіктердің. Кейде қоректік ортаға будан ұрыктың қасына тақап немесе аналық өсімдіктердін эндосперм, нуцеллус және басқа көбею жүйесінің бөліктерін отырғызу жақсы нәтиже береді.

Әрбір өсімдіктін түрінде автономдық фазасын аныктау өте маңызды, өйткені сол кезден ол құрамы қарапайым гормоны жоқ ортада дербес өз алдына дами алады. Шұғынықтың ұрықтарынын автономдығы жүрек тәрізді кезенінде, яғни тұқым жарнақтары дифференцияланғанда жүзеге асады.

Сонымен бірге ұрықтарды өсіру үшін олардың дамуына және өнуіне лайыкты коректік орта керек. Универсалдық қоректік орта болмағандыктан, әр жолы оның құрамын іріктеп алу кажет. Кейбір өсімдік түрлерінің эмбриогенезіне азоттың органикалык түздары, калийдің жоғары концентрациясы әсер етеді. Ұрыктың дифференциялануы мен өсуіне әр түрлі ерекше қоректік орталар кажет. Ұрықтар жиі каллус түзеді, органогенез нәтижесінде регенерант өсімдіктер шығады. Каллусогенез процесі мен каллустың морфогендік потенциалы көптеген факторларға байланысты (генотип, ұрықтың дифференциялану денгейі, қоректік ортаның құрамы т.б.)

Тәжірибелер көрсеткендей, көбінесе морфогендік каллус ұрықтың дәнжарнағынан пайда болады. Әр түрлі өсімдіктердің ұрықтары шамасы бірдей даму кезенінде каллус бере алады. Мысалы, арпаның ұрыкгары 0,8-2,0 мм (яғни тозанданудан 10-14 күннен кейін), жүгерінін - 1,0-1,25 мм, тритикаленін - 1,0-2,0 мм болып дамығанда каллус береді. Одан үлкен ұрыктар көбінесе өніп тікелей алғашкы өркенді шығарады, бірак олардан каллус түзілмейді.

Каллусты алу, одан кейін регенерант өсімдіктерін шығару кейбір жағдайда ерекше манызды болады. Бұл әдіс әсіресе алшак, әріден будандастырғанда туысаралық будан өсімдіктер алу үшін кажет. Мысалы, будандастырған парлар генетикалық сыйымсыздығы салдарынан будан ұрық, одан будан өсімдік шығару мүмкін емес. М.Ф. Терновский дамып жетілмеген ұрықтан шыққан каллус аркылы темекінің екпе және жабайы түрлері арасындағы туысаралық будандарды алды. Осы жолмен бидайыктың диплоидтык және тетраплоидтык формалары арасынан будандар алынды. Әдетте мүндай будандар алу тіпті мүмкін емес еді, себебі будан тұқымдардың өскіндері тұқым жарнақтары шыққан кезде олардың алғашқы тамырлары өспей, өсімдіктің дамуы шектеледі. Ал биотехнологиялық әдіспен сол өскіндердің каллустарын өсіріп, будан регенерант өсімдіктер алуға болады.

Ең алғашкы даму кезеңдегі ұрыктардан өсімдіктер алудын тағы бір жолы бар, ол тұқым бүршіктері мен түйіндерді іn vitroжағдайында өсіру. Бұнда ұрыктар түкымнан жеке бөлініп алынбағандыктан, ешбірі закымданбайды және оларды тіпті зигота кезеңінен өсіруге мүмкіншілік туады. Бүл әдіспен будан ұрыктарды аман сактап калуға болады.

Бірақ көптеген өсімдіктерде эндоспермі жок түкым бүршіктерінен тіршілікке икемді тұқымды алу қиын. Бөлініп алынған тұкым бүршігінін орталык клеткасында ең болмағанда бірлі-жарым эндоспермнің ядролары болғанда ғана, калыпты морфргенез өтеді. Ал кейбір өсімдіктерде (шие, кызыл шие) эндоспермнін кызметін түкым бүршігінің басқа ұлпалары аткарады, сондықтан ұрык эндосперм болмаса да зиготаның өзінен өсіп жетіледі. Тұкым бүршігі түйінмен бірге бөлініп алынғанда эмбриогенез зигота сатысынан бастап әдеттегідей жалғаса береді. Оның себебі туралы болжамдар бар. Мүмкін іn vitroжағдайында бүрбүртікте беймәлім морфогендік фактор түзіледі, ол жылжып келіп эндосперм дамуына онды әсер етеді. Бұл туралы мынаны да айта кету орынды. Эмбриогенезде болатын гормондык және ұлпааралық әрекеттестік жөнінде көптеген бағалы деректер бар. Олар әр түрлі даму кезеңдеріндегі ұрықтарды, ұрықбүршіктерді және түйіндерді іn vitroжағдайында өсіру нәтижесінде алынған. Сөйтіп, ұрыкты өсіру әдісі эмбриогенездін теориялык талай мәселелерін шешу үшін қолданылады. Сонымен бірге бүл әдістің практикалық селекция үшін де манызы зор.

Постгамдық сыйымсыздыкты жеңуден басқа, ұрықты өсіру әдісі селекция процесін айтарлықтай жылдамдатады. Атап айтканда, мынадай колайлы мүмкіншіліктер туады:

1) ұрыктардың өнуі тежелетін тыныштык кезеңін жою;

2) өсімдіктердін көбею циклін қысқарту;

3) өсімдіктердің өздігінен тозанданбауын жену;

4) тұқымның өнгіштік қабілетін тез аныктау;

5) түкым өнгіштігін күшейту.

Өсімдіктердін жана сорттарын шығарғанда селекционсрлер будан түкымдарынын нашар өнгіштігімен жиі кездеседі. Мысалы, шүғылыктын екпе түрлерін жабайы түрлерімен будандастырғанда будан тұқымы өте қиын өнеді, тіпті өнбей де қалады. Орхидея тұқымдарының да өнгіштігі төмен болады. Олардың будан өсімдіктерін көбейту үшін ұрықты жасанды ортада өсіру әдісі қолданылады. Бұл әдісті тұқымды тыныштық күйінен ояту үшін пайдаланады. Мысалы, магнолия, зәйтүн пальмасы, құртқашаш, орхидея тұқымдарының тыныштык кезені өте ұзакка созылады. Бұл өсімдіктердің тұқымдары көп жылдан кейін ғана өнеді, ал іn vitroжағдайында солардан алынған будан тұқымдары тез өсіп шығады. Ұрыкты іn vitro өсіру әдісі тұкымның тыныштық кезеңі мен оның реттелуін білу үшін қолданылады және ұрықтың өскінге айналу процесінің. ізділігін зерттеуге пайдаланылады.

Ұрықты өсіру өсімдіктің тіршілік циклін жылдамдатып, селекциялық жұмыстың мерзімін қысқартады. Мысалы, күздік бидайдын 16-20 күндік ұрықтарын бөліп алып, яровизациядан өткізсе, бидайдың генерация уакыты 40 күнге қысқарады.