Бакпрепараты.

1. Биохимические свойства кишечной палочки. Рост ее на средах Эндо, Левина.

2. Опыт определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков.

3. Биологический метод культивирования анаэробов по Фортнеру.

4. Среды для культивирования анаэробов: Китт-Тароцци. тиогликолевая, Вильсон-Блера.

5. Фаготипирование бактерий.

6.Определение фермента лецитовителазы у патогенного стафилококка на желточно-солевом агаре Чистовича.

Практические навыки

1.Приготовление и окраска препарата.

2.Работа с иммерсионным микроскопом.

3.Окраска препарата по Граму.

4.Посев на скошенный МПА петлей.

5.Посев на чашку смеси микробов для выделения чистой культура.

6.Определение лекарственной чувствительности микробов.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ.

1.История открытия микроорганизмов работы Антонию Левенгука.

2.Значение работ Л. Пастора, Р. Коха, Д.И. Ивановского в развитии медицинской микробиологии.

3.Современные методы микроскопического исследования. Принципы темнопольной, фазовоконтрастной, люминесцентной и электронной микроскопии. Разрешающая способность и увеличение светового биологического микроскопа.

4.Размер и измерение микроорганизмов.

5.Генетические рекомбинации у микроорганизмов: конъюгация, трансдукция, трансформация

6.Генная инженерия. Её значение для медицинской практики.

Тема 6 формы изменчивости микроорганизмов. Общая характеристика вирусов. Бактериофаги.

Цель занятия: изучить основные положения учения о наследственности и изменчивости микроорганизмов; ознакомиться с общими свойствами вирусов, изучить основные свойства бактериофагов и практическое применение.

Основные вопросы темы

1.Основные закономерности изменчивости как общебиологическая проблема.

2. Формы изменчивости, фенотипическая и генетическая изменчивость.

3. Мутации, их механизм.

4. Рекомбинации ДНК и способы передачи генетической информации между бактериями: трансформация, конъюгация, трансдукция.

5. Плазмиды как внехромосомные факторы наследственности.

6. Общая характеристика вирусов.

7. Природа и свойства бактериофагов, механизм взаимодействия фага с бактериальной клеткой /вирулентные и умеренные фаги/.

8. Применение бактериофагов для профилактики, лечения болезней и идентификации бактерий.

БЛОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ИНФОРМАЦИИ.

1. Формы изменчивости микроорганизмов.

Изменчивость микроорганизмов может возникать под действием внешних факторов и связана, в основном, с образованием индуцированных ферментов. Такие изменения являются фенотипическими, не наследуются и сохраняются в течение действия внешнего фактора.

Наследуемые изменения у микроорганизмов являются следствием нарушений генетической информации и связаны, в основном, с мутациями и генетическими рекомбинациями. Основой наследственности у бактерий и вирусов служит ДНК. Бактериальная ДНК замкнута в кольцо. Эта структура называется нуклеоидом или бактериальной хромосомой. Сохранение генетической информации поддерживается точным воспроизведением ДНК в репликации и системой репарации ДНК. Репаративная система представляет комплекс белков ферментов /конститутивные и индуцибельные/, которые находят поврежденные участки ДНК, разрушают их, затем полимеразы синтезируют новый участок, а лигазы вшивают его в цепочку.

Внехромосомные факторы наследственности представлены плазмидами, транспозонами и Is-последовательностями, которые представляют молекулы ДНК. Они не являются жизненно необходимыми для бактерий, но придают им селективные преимущества.

Плазмиды могут быть связаны с хромосомой и делятся вместе с ней или находятся в свободном состоянии в цитоплазме, где может происходить их автономная амплификация. Плазмиды несут генетическую информацию:

F - плазмиды способствуют конъюгации,

Rtf - множественной устойчивости к антибиотикам,

End - плазмиды контролируют синтез токсина,

Hly – плазмида - синтез гемолизина.

Плазмиды могут контролировать синтез факторов вирулентности и устойчивости микробов к различным воздействиям внешней среды /к свету, ультрафиолету/, могут менять скорость размножения бактерий.

Транспозоны всегда связаны с хромосомой, они несут информацию для транспозиции, при включении в ДНК способны перемещаться с одного репликона на другой, вызывая дупликации или делеции и инверсии. Они могут нести информацию для синтеза токсинов и ферментов, обуславливают антимикробную устойчивость к одному фактору.

Is-последовательности (inscription – вставка, sequencl – послежлвательность) - это фрагменты ДНК, в которых содержится информация для их перемещения в различные участки ДНК. Они вызывают делеции или инверсии, а при включении в хромосому - дупликации. Они кодируют взаимодействие транспозонов, плазмид и умеренных фагов между собой и обеспечивают их рекомбинацию.

Изменения генетической информации микроба связаны в основном с мутациями и генетическими рекомбинациями.

Мутации бывают:

1. Спонтанные (радиация, световой фон, ошибки ДНК – полимеразы).

2. Индуцированные - причина их возникновения связана с мутагенными факторами (физическими, химическими, биологичес­кими).

а). точковые - замена основания.

б). транспозиция - перенос участка ДНК с одного на другой.

в). трансверсия - переворот на 180 градусов.

г). амплификация генов - вставочные мутации, ДНК становится больше.

д). делеции - выпадение участка ДНК.

Последствия мутаций:

1. Нейтральная - изменения не проявляются.

2. Условно-летальные изменения имеются, но фермент не утрачивает активности.

3. Летальная - утрата функциональной активности, не синтезируется жизненно важный для клетки фермент.

4. Повышающие жизнеспособность, встречаются крайне редко.

Рекомбинации ДНК и передача генетической информации между бактериями происходит путем трансформации, трансдукции и конъюгации.

Трансформация - передача генетической информации от одной бактерии к другой без их непосредственного контакта. Трансформацию открыл Ф. Гриффитц, который показал способность экстракта капсульного пневмококка индуцировать вирулентность и образование капсулы у бескапсульного пневмококка. Трансформация чаще происходит между разновидностями, типами и штаммами микробов одного вида и осуществляется донором и реципиентом. Донор отдает ДНК, а реципиент воспринимает ее. Донором являются клетки с максимальной скоростью размножения, часть ДНК попадает в окружающую среду, где и захватывается реципиентом. Реципиентом являются клетки со сниженной скоростью размножения в состоянии фазокомпетентности, на поверхности этих клеток появляются белки- трансформосомы, которые связывают ДНК в окружающей среде. Этот процесс идет активнее у грамположительных бактерий, а у грамотрицательных бактерий переносу ДНК мешает наружная мембрана клеточной стенки. При трансформации приобретаются один или два признака донора, чаще передаются капсульные и поверхностные антигены, резистентность к лекарственным препаратам, способность синтезировать факторы роста и ферментировать углеводы.

Конъюгация –передача генетической информации между бактериями при их непосредственном контакте. Клетка - донор имеет специальные плазмиды фертильности (F-плазмиды), эта клетка имеет специальные sex- реснички, которые служат для сближения клеток донора и реципиента и образования между ними протоплазматических мостиков.

F- фактор, включенный в ДНК дает высокую частоту рекомбинаций.

Hfr - форма расщепляет двойную спираль (ДНК), превращая ее из кольцевой молекулы в линейную и транспортирует ее в клетку реципиента,

Оставшаяся в клетке донора ДНК восстанавливает свою первоначальную структуру, достраиваясь до двойной спирали. При конъюгации от донора к реципиенту могут передаваться плазмиды, автономно расположенные в цитоплазме.

Конъюгация чаще происходит у медленно делящихся клеток. У грамотрицательных бактерий в этом процессе участвуют две клетки (донор и реципиент), а у грамположительных бактерий в конъюгации одновременно участвует 50-100 клеток, эти скопления называют клампами.

Конъюгация лучше возникает при внутривидовом скрещивании бактерий, но возможна и межвидовая рекомбинация, которая часто происходит у бактерий кишечной группы, воспроизводится между кишечными палочками, шигеллами, сальмонеллами, клебсиеллами, холерным вибрионом.

Трансдукция - передача генетической информации из одной микробной клетки в другую с помощью бактериофагов. Этот процесс может осуществляться как умеренными, так и вирулент­ными фагами.

Для умеренных фагов характерен переход к продуктивной инфекции, что чаще связано с действием ультрафиолетового облучения или радиации, при этом происходит повреждение хромосомы клетки и вирусная ДНК в процессе сборки вириона соединяется с одним или несколькими генами хромосомы клетки хозяина. Неправильно вылепленный геном вируса начинает реплицироваться, образуется множество копий, каждая из которых содержит гены клетки донора. Синтезируются белки капсида бактериофага, и из клетки выходит популяция вирусов, где каждый из вирусов содержит один или несколько генов клетки донора.

Дальше, взаимодействуя с клеткой-реципиентом, геном вируса встраивается в хромосому клетки вместе с генами из хромосомы клетки донора.

Трансдукцию, осуществляемую умеренными бактериофагами, подраз­деляют на общую, специфическую и абортивную. При общей трансдукции вирус встраивается в различные места хромосомы клетки-донора. Специфическая трансдукция характерна для бактериофага, встраивающего свой геном в строго определенное место хромосомы донора. При абортивной трансдукции перенесенный ген не встраивается в хромосому клетки реципиента, а остается в цитоплазме. При делении клетки этот ген остается в одной клетке и происходит постепенное утрачивание нового признака.

У вирулентных фагов в процессе сборки вирионов образуются дефектные вирусы, содержащие внутри капсида участок ДНК клетки донора, который они и переносят в цитоплазму клетки-реципиента, но не вызывают процесса репликации вирусов.

Трансдукция, осуществляемая умеренными бактериофагами, включает этап амплификации, то есть увеличение копий переносимого гена, что весьма важно в изменчивости микроорганизмов.

В процессе трансдукции передается генетическая информация об антигенной структуре бактерий и осуществляется передача факторов вирулентности.