Тақырып 3.2. Бактериялардың идентификациясы

Кіріспе. Идентификация – микробтың түрлік тегін анықтау (қою). Қазіргі уақытта жалпылай қолдау тапқан идентификация әдісі зерттелуші материалдың едәуір маңызды фенотиптік белгілерінің айқын жиынтықтарын пайымдауға негізделген. Идентификация үшін критерийлер микробта сол түрге тән негізгі нышандардың жиынтығы (таксономиялық белгілер) бар болуы болып табылады. Түрді бекіту бактериялардың халықаралық таксономиясымен (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology) келісіле жүргізіледі.

Бактериялардың негізгі түрлік нышандарына мыналар жатады:

▪ микробты жасушаның морфологиясы;

▪ тинкториялық қасиеттері – қарапайым және күрделі бояу әдістерімен боялу ерекшеліктері;

▪ дақылдық белгілері – микробтың қоректік ортада өсу ерекшеліктері;

▪ биохимиялық белгілері бактерияда әртүрлі химиялық қосылыстарды синтездеуге немесе ыдыратуға (ферментациялауға) қажетті ферменттердің болуы;

Бактериологиялық тәжірибеде көбінесе қантеріткіштік және ақуызеріткіштік ферменттерді пайымдайды.

Идентификация кезінде қолданатын қосымша белгілерге мыналар жатады;

▪ түрспецификалық антигендердің болуы (10 шы тарауды қара);

▪ түрспецификалық бактериофагтарға сезімталдылығы (5 ші тарауды қара);

▪ белгілі-бір антимикробты препараттарға түрлік резистенттілігі;

▪ патогенді бактериялар үшін – вируленттіліктің белгілі-бір факторларын өндіру.

Биоварға дейінгі ұсақ түрлік идентификация (серовар, фаговар, ферментовар т.б.) – типтеу – мынадай сәйкес маркерлерді айқындауға негізделген: антигенді (серотиптеу, 10-шы таруды қара), типтік бактериофагқа сезімталдылығын (фаготиптеу, 5-ші тарауды қара) және т.б.

Соңғы жылдары идентификацияның жетілген биохимиялық және молекулярлы-биологиялық әдістері өңделіп, қолдана басталуда: хемоидентификация, нуклеин қышқылдарының талдамасы: рестрикциялық талдама, гибридизация, полимеразды тізбектік реакция (ПТР), риботиптеу және т.б.

▲ Әдістемелік нұсқаулар

Биохимиялық идентификация. Бактериялардың биохимиялық белсенділігін

бағалау үшін мынадай реакциялар қолданылады:

1. ферментация – субстраттың аралық өнімге дейін жартылай ыдырауы, мысалы көмірсулардың органикалық қышқылдар түзе ферментациялануы;

2. тотығу – органикалық субстраттың СО₂ және Н₂О дейін толық ыдырауы;

3. ассимиляцияны (утилизация) – көміртегінің немесе азоттың көзі ретінде өсу үшін субстратты қолдану;

4. субстраттың диссемиляциясы (деградациясы);

5. субстраттың гидрозизі.

Микобтарды биохимиялық белгілері бойынша идентификациялаудың классикалық (дәстүрлік) әдісі, - таза дақылды белгілі-бір субстраты бар дифференциалды-диагностикалық орталарға микроорганизмнің сол субстратты ассимиляциялау қабілетін бағалау немесе оның метаболизмінің соңғы өнімдерін анықтау мақсатында себуге негізделеді. Зерттеуге 1 тәуліктен аз уақыт кетеді. Оған Гисс ортасына себу арқылы ( қысқа және ұзын "ала қатарға") бактериялардың қантеріткіштік белсенділігін (көмірсуларды ферментациялау қабітеттілігі) бағалау мысал бола алады.

Б а к т е р и я л а р д ы ң б и о х и м и я л ы қ н ы ш а н д а р ы н

"ш ұ б а р қ а т а р" о р т а л а р ы н ы ң к ө м е г і м е н и д е н т и ф и к а ц и я л а у. Қысқа "ала қатардың" құрамында моно- және дисахаридтері – глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза және 6 атомды спирт – манниті бар Гиссның сұйық орталары кіреді. Ұзын "ала қатарға" жоғарыда аталған көмірсулармен қоса құрамында әртүрлі моносахаридтер (арабиноза, ксилоза, галактоза, т.б.) мен спирттер (глицерин, дульцит, инозит т.б.) бар Гисса сұйық орталары кіреді. Бактериялардың көмірсуларды ферменттеу қабілетін бағалау үшін қоректік орталарға ыдыраудың қышқыл өнімдерінің түзілуін (органикалық қышқылдарды) айқындауға мүмкіндік беретін индикаторлар (Андраде реактиві, т.б.) және СО₂-ын айқындауға арналған "қалытқы" қосады.

Зерттелуші микроорганизмнің таза дақылын құрықпен "ала қатар" ортасына себеді. Себіндіні 18-24 сағатқа немесе одан да көп уақытқа 37°С-тық термостатта инкубациялайды. Егер бактериялар көмірсуды қышқылдық өнімдерге дейін ферменттесе, ортаның түсі өзгергені байқалады; көмірсуды қышықыл мен газтектес өнімдерге ыдыратса түс өзгеруінмен қатар қалытқыда газ көпіршіктері пайда болады. Егер жартылай сұйық агарлы орталар қолданылса, онда газдың түзілуі бағананың ыдырауы бойынша тіркеледі. Ферментация болмаса орта түсі өзгермейді. Бактериялар барлық ферменттерді емес, тек Гисс ортасының құрамына кіретін көмірсулардың қайсы бір түрлерін ғана ыдырататындықтан ала-ала бейне байқалады. Сондықтан, көмірсулар мен түрлі түсті индикаторы бар орталар жиынтығын "ала қатар" деп атайды. (3.2.1. сурет; жапсырмада).

Протеолиттік ферменттерді анықтау үшін бактерия дақылдарын пептон суына және 10-20 %-ті желатин бағанасына шаншып егу жүргізеді. Желатиндегі себулерді 20-22°С та бірнеше күн бойы инкубациялайды. Протеолиттік ферменттері бар болған жағдайда бактериялар желатинді ұңғыма немесе төңкерілген шырша тәрізді бейнеде ыдыратады.

Пептон суына себінділерде 2-3 тәуліктік 37°С-тық инкубациядан соң, аминқышқылдарының ыдырау өнімдерін анықтаймыз. Ол аммиякқа, индолға, күкіртсутегіге және т.б. реакциялар қою арқылы жүзеге асады.

А м м и я к қ а р е а к ц и я. Лакмус қағазының жіңішке қағазшасын қоректік ортамен жанаспайтындай етіп тығынға бекітеді. Қағаздың көк түстенуі аммияктың түзілуінің айғағы.

И н д о л ғ а р е а к ц и я. Эрлих әдісі: бактериялық дақылы бар шыны түтікшеге 2-3 мл эфир қосамыз да оны жақсылап араластырып, үстінен бірнеше тамшы Эрлих реактивін (хлорлысутекті қышқылы бар парадиметиламидобензилальдегидтің спиртті ерітіндісін) тамызамыз. Индолдың бар болуында ортаның қызғылт боялуы байқалады, абайлап қабаттайтын болса қызғылт сақиналар түзіледі.

К ү к і р т с у т е г і г е р е а к ц и я. Темір сульфаты сіңген фильтірлік қағаздың жіңішке парақшасын пептон суы бар шыны түткікшенің тығынына қыстырамыз. Қағаз қоректік ортаға тимейтіндей орналасуы қажет. Күкіртсутегі бөлінген кезде қағазды қара түске бояйтын ерімейтін темір сульфиді (FeS) түзіледі (3.2.1.). H₂S өндірісін де осылайша бактерия дақылын H₂S-ді айқындайтын реактиві (тұздар араласпасы: темір сульфаты, натрийдің тиосульфаты, натрий сулфиті) бар бағаналы қоректік ортаға шаншып егу арқылы анықтауға болады. Оң нәтижеде FeS-ің түзілуі есебінен орта қара түске боялады.

К а т а л а з а н ы ң б а р е к е н д і г і н а н ы қ т а у. Бұйым шынысына 1-3 % сутегі тотығының ерітіндісін тамызамыз да бактериялық дақылы бар құрықты ендіреміз. Егер бактерияда каталаза ферменті болса ол сутегі тотығын оттегі мен суға, газ көпіршіктерін бөле отырып, ыдыратады.

Бактериологиялық тәжірибеде егер, идентификация үшін жеткілікті болса, кейде зерттелуші бактерияның қантерткіштік және ақуызерткіштік нышандарын пайымдаумен шектеледі. Қажет болған жағдайда басқа белгілерін де зерттейді, мысалы, нитраттарды тотықсыздандыруын, амин қышқылдарын карбоксильдеуін, оксидаза, плазмокоагулаза, фибринолизин, және басқа ферменттер түзуін.

Таза дақылды идентификациялау бойынша жұмыстардың нәтижелерін хаттамалайды (кесте 3.2.1).

Концентрацияланған субстраттар мен реакцияның ақырғы өнімдерін табуға едәуір сезімтал әдістерді қолдануға негізделген 2-ші ұрпақтық биохимиялық тесттер микробтық жасушада бар ферменттерді айқындауға мүмкіндік береді де осылайша, зерттеу үрдісінде бактерияны қосымша өсіріп-өндіруді талап етпейді. Бұл зерттеу мерзімін елеулі түрде қысқартуға (4сағ) мүмкіндік береді.

Концентрацияланған субстраттар мен реакцияның ақырғы өнімдерін табуға едәуір сезімтал әдістерді қолдануға негізделген 2-ші ұрпақтық биохимиялық тесттер микробтық жасушада бар ферменттерді айқындауға мүмкіндік береді де осылайша, зерттеу үрдісінде бактерияны қосымша өсіріп-өндіруді талап етпейді. Бұл зерттеу мерзімін елеулі түрде қысқартуға (4сағ) мүмкіндік береді.

3-інші ұрпақтық биохимиялық тесттер хромогендермен немесе флюрохроммен таңбаланған субстраттарды қолдануға негізделген. Мұндай кешен боялмаған немесе флюоресценцияланбайды. Таңбаланған субстраттың микроб ферментімен бұзылуы кезінде таңба басап шығады да боялып немесе флюоресценцияланып айқындалады. Мұндай тесттер зерттеу материалының алғашқы себуі кезінде алынған бірең-сараң бактериялық колонияларды толық биохимиялық идентификация үшін қолдануға мүмкіндік береді, яғни екі кезеңдегі таза дақыл бөліп алу үрдісін қысқартады.

Зертханалық тәжірибеде адам ауруларының қоздырғыштары – микроорганизмдердің негізгі топтарын идентификациялау үшін дайын микротест-жүйелер (МТЖ) қолданылады. Қазіргі МТЖ-де нәтижелердің есебі мен олардың интерпритациясы автоматты түрде компьютерлік талдама жүйесі көмегімен жүзеге асады.

Идентификацияның биохимиялық және молекулярлы-генетикалық әдістері. Хемоидентификация – микробтық жасушаның химиялық құрамы бойынша идентификациясы. Кез-келген ағзаның құрамына биомолекулалардың 4 негізгі класы кіреді: нуклеин қышқылы, ақуыздар, көмірсулар, липидтер. Хемоидентификация ең алдымен микробтық липидтердің талдамасына негізделген. Өйткені, биополимерлер ішінде олар мономерлердің едәуір көптүрлілігімен сипатталады (алуан түрлі бактерияларда 300-ден астам әртүрлі май қышқылдары мен олардың туындылары табылған). Бұл липидтерінің сандық және сапалық құрамы бойынша (май қышқылдары, эфирлер, спирттер, хинондар мен т.б.) әралуан түрлерге жататын микробтарды ажырата білуге мүмкіндік береді. Микробты жасушаның химиялық құрамының талдамасы хромотография әдісінің көмегімен жүзеге асады. Едәуір кең қолданатыны газдысұйықтықты хромотография әдісі. Әдіс, көбінесе, метаболизмдерінің негізгі өніміне жататын қысқа көміртегілік тізбекті май қышқылдарының (9-20 көміртегі атомы) құрамы бойынша анаэробты бактерияларды идентификациялау және де баяу өсетін бактериялар (микобактериялар) мен төменгі ферментативті белсенділігі бар бактериялардың идентификациялау саласында жиі қолданылады.