Сурет 10.2.5 Кумбс реакциясы (схема). Түсіндірмесі текстте.

10. Флоккуляция реакциясы. Токсиннің немесе анатоксиннің антитоксикалық сарысумен әсерлесуі нәтижесінде флоккулят үлпектері түседі. Едәуір интенсивті және ерте (инициальді) флоккуляция антиген мен антидене эквивалентті қатынаста болатын түтікшеде жүреді.

Реакцияны екі кезеңде қояды. Алдыменен стандартты сарысумен 1 мл токсиндегі флоккуляцияның шектік өлшемін Lf (Limes flocculationis) бекітеді. Токсиннің Lf-і сарысудыдың халықаралық бірлігімен (ХБ) инициальді флоккуляция беретін оның минимальді өлшемімен анықталады. Токсиннің күшін бекіткен соң антитоксикалық сарысуды титрлеуге кіріседі. Белгілі күштегі токсин мен зерттелетін антитоксикалы сарысуды 10.2.3-ші кестеде көрсеткендей, белгілі көлемде түткішелерге құяды. Түтікшелерді су моншасында 45°С-та 30 минут бойы олардың бірінде үлпектер түскенше ұстайды.

К е с т е 10.2.3. Флоккуляция реакциясы (хаттама қалыбы)

Іс-шаралар	Түтікшелер нөмірі
	1	2	3	4	5	6	7
1 мл-де 20 Lf бар токсин ерітіндісін енгізу, мл	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0
Зерттелетін сарысуды енгізу, мл	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	-	0,6
45°С-та 30 минут бойы инкубациялау
Инициальді флоккуляция бойынша нәтижелердің есебі

Инициальді флоккуляция токиннің мөлшері сарысудың халықаралық бірлігіне сәйкес келетін түтікшеде айқындалады. Мысалы, флоккуляция 3-ші түтікшеде болды делік, демек, 0,4 мл сарысуда 40 ХБ бар. Яғни, 1 мл сарысуда 40:0,4=100 ХБ бар деген сөз.

11. Антистрептолизинді реакция. Реакция микробтық токсиннің (О-стрептолизиннің) гемолитикалық әсері иммунды сарысудың антитоксикалық антиденелермен бейтараптану (нейтрализациялану) феноменіне негізделген.

Реакцияны жүргізу үшін алдын-ала токсиннің минимальді гемолитикалық дозасын (О-стрептолизинді), яғни, қоян эритроциттерінің 0,2 мл 5%-ті қоспасының гемолизін тудыратын оның ең аз мөлшерін анықтайды. Одан соң О-стрептолизиннің жұмыстық дозасын, яғни, токсиннің стандарты антитоксикалық сарысудың ¹/₂ АБ-дегі (антитоксикалық бірлік) қоспасында толығымен бейтараптанатын және эритроциттердің гемолизин тудырмайтын ең көп мөлшері. Негізгі тәжірибені қою үшін зерттелетін сарысудың сұйылтпаларын жасап, әрқайсысына токсиннің жұмыстық дозасын құяды, 37°С-та 45 минут бойы инкубациялайды да эритроциттер қоспасының бірдей өлшемін ендіріп, 37°С-та 1 сағат және 18 сағат бөлме температурасында инкубациялайды. Міндетті түрде эритроциттердің спонтанды гемолиздену мүмкіндігіне де бақылау қояды. Оң нәтиже ретінде гемолиз болмаған реакция есептеледі. Гемолиз толық тежелуі байқалатын сарысудың максимальді сұйылтпасын ескере отырып 1мл зерттелуші сарысудағы АБ-ін есептейді (кесте 12.1.3. қара).

12. Гемагглютинацияны тежеу реакциясы. ГАТР-сы мынаған негізделген; вирустық антигендердің (гемагглютининдердің) иммунды сарысудың спецификалық антиденелерімен әсерлесуі кезінде вирустың гемагглютинациялаушы қабілетінің бөгелуі (бейтараптануы), яғни, гемагглютинацияның тежелуі жүреді.

К е с т е 10.2.4. Антигендер мен антиденелердің сандық анықталуларының әртүрлі әдістерінің салыстырмалы сезімталдылықтары

Тестілер	Айқындалушы мөлшері, мкг/мл
	антиденелердің	антигендердің
Преципитация	20,0	0,1
Иммуноэлектрофорез	20,0
Комплемент байланыстыру	0,5
Радиальді иммунодиффузия	0,05	0,5
Бактериялардың агглютинациясы	0,01
Гемолиз	0,01
Тікелей емес (пассивті) гемагглютинация	0,01
Гемагглютинацияның ингибициясы		0,001
Токсиннің нейтролизациясы	0,01
Радиоиммунды талдама	0,0005	0,000005
Иммуноферментті талдама	0,0005	0,000005
Вирустардың нейтролизациясы	0,000005

Айқарылған ГАТР пластмассалы пластинкалар ойықтарында жүргізіледі. Жұмыстық дозаны айқындау мақсатында алдын-ала гемагглютинация реакциясында вирустық антигеннің титрін анықтайды. Жұмыстық сұйылтпаны титрден 116 есе төмен алады. Ойықтарда зерттелетін сарысудың 0,25 мл көлемдегі 2-мәртелік сұйылтпаларын дайындайды, оған жұмыстық сұйылтпадағы вирустың 0,25 мл қоспасын қосады да 37°С-та 2 сағат инкубациялайды. Одан соң, 0,5 мл 1%-ті тауық эритроциттерінің қоспасын қосады, тағы да 2 сағат инкубациялаған соң нәтижені гемагглютинация феномені бойынша бағалайды. Оң нәтижелі ГАТР кезінде ойық түбінде дискі немесе шеттері тегіс сақина түрінде эритроцитердің тығыз тұнбасы түзіледі. Антиденелер титрін ГАТР-сының оң нәтижелі соңғы ойығы бойынша анықтайды.

Антигендер мен антиденелердің сандық анықтауларының әртүрлі әдістері олардың сезімталдылықтары бойынша, яғни, сол әдістің көмегімен айқындала алатын антиденелердің немесе антигендердің минимальді мөлшері бойынша кәдімгідей ерекшеленеді (кесте 10.2.4).

Тақырып 10.3. АДАМ АҒЗАСЫНЫҢ ИММУНДЫҚ СТАТУСЫН

БАҒАЛАУ ӘДІСТЕРІ

Адамның иммундық статусы ағзаның антибактериялық, антивирустық және ісікке қарсы қорғанысын қамтамасыз ететін бейспецификалы және спецификалы механизмдер кешенінен құралады. Бактерияларға қарсы бейспецификалық қорғаныс механизмдеріне гранулоциттермен және моноцит-макорфагтармен жүретін фагоцитоз бен альтернативті жол бойынша комплемент жүйесінің активациясы жатады. Макрофагтар бактерияларды қармап, оларды жоюмен ғана шектелмейді, сонымен қатар бактериялармен байланысу барысында биологиялық белсенді молекулалар - цитокиндерді секрециялайды. Цитотоксиндер қабынудың бейспецификалық қорғаныс үрдісін іске қосады. Вирусқа қарсы және ісікке қарсы қорғаныстардың бейспецификалық механизмдері: жасушалар – шынайы жоюшылар және интерферон әулиетінің молекулалары. Жасушадан тысқары паразиттеуші бактерияларға қарсы спецификалық антибактериялық қорғанысты фагоцитозды күшейту (опсонизация) және классикалық жолмен комплемент жүйесін активациялау арқылы спецификалық антиденелер – иммуноглобулиндер қамтамасыз етеді. Бактериялық токсиндерден спецификалық қорғаныс қызметін бактериялардың экзотоксиндерін бейтараптауға қабілетті спецификалық антитоксикалық антиденелер – иммуноглобулиндер атқарады. Жасушаішілік паразиттеуші микроорганизмдерға қарсы спецификалық қорғанысты активтенген Т-лимфоциттер мен макрофагтар атқарады. Олар инфекция ошағында иммунды қабыну реакциясының – баяуланған типті гиперсезімталдылықтың (БТГ) дамуын қамтамасыз ете отырып, мынадай цитотоксиндер бөледі: интерлейкин, гамма-интерферон, ісіктер некрозының факторлары. Лимфоциттердің әріқарайғы дифференцациясы беткейлік маркер деп аталатын бұйымтайларына негізделеді. Мұндағы бұйымтай деп отырғанымыз – спецификалы моноклонды антиденелермен әсерлескенде айқындалатын жасуша мембранасының құрамындағы антиген ретіндегі ерекше молекула (оларды ағылшынның қысқартылған термині ретінде "CD" – "clusters of differentiation" –деп атайды).

Жасушалық популяцияның және субпопуляцияның сапалық (функциональді) бағалануы сәйкс функциональді тестілердің көмегімен жүргізіледі: Т- және В лимфоциттерде стандартты митогенді немесе микробты антигендермен жанасуға пролиферативті жауабы (лимфоциттердің бластотрансформация реакциясы – ЛБТР) немесе митогендермен байланысуына цитотоксиндер өндіру жауабы бағаланады. Фагоциттеуші жасушаларда фогоцитоз қызметі бағаланады: стандартты бөлшектердің – фагоцитоз объектілерінің қармалу белсенділігі, фагоциттердің бактериоцидтілігі фагоцитозбен индукцияланған тотығу жарылысының биіктігі (НСТ-тест) бойынша жанама бағаланады. Иммуноглобулиндер молекулаларының төрт негізгі изотиптерінің – класстары ның (IgG, IgM, IgA, IgE) қан сарысуындағы және басқа да биологиялық сұйықтықтардағы (сілекей, жұлын сұйықтығы және т.б.) концентрациясын осы иммуноглобулиндердің изотипоспецификалы антигендеріне қарсы алынған спецификалы моноклональді антиденелер жинынтығын қолдана отырып анықтайды. Антиденелердің мұндай жиынтығы көмегімен кешен түзілу реакциясын (қан сарысуында қатысушы иммуноглобулиндер бұл реакцияда антиген қызметін атқарады) жүргізуге болады, олардың нәтижелері нефелометрдің немесе спектрофотометрдің көмегімен сандық есептеуге оңай көндігеді. Санаудың басқа нұсқасы – сол белгілі изотипоспецификалы моноклональді антиденелердің және тышқан иммуноглобулиндеріне қарсы пероксидазамен таңбаланған антииммуноглобулинді сарысудың қатысуымен (өйткені, барлық моноклонды антиденелер тышқандардың жасушаларынан алынған) қаттыфазалы иммуноферментті талдама жүргізу болып саналады..

▲ Әдістемелік нұсқаулар

1. Қанның фагоциттеуші жасушаларын бағалау әдістері. Қан үлгісін немесе лейкоқоспаны бактериялармен немесе басқа фагоцитоз объектілерімен (латекс бөлшектері) бірге 1-2 сағат бойы инкубациялайды да осы қоспадан жағынды дайындап, Романовский-Гимзе әдісімен бояйды, фагоцитеуші жасушалар проценті мен осы жасушаларға қармалған бактериялар (бөлшектер) санын анықтау үшін 100 жасушаны санап ала микроскоппен қарайды. (сурет 10.3.1; жапсармада). Қалыпты жағдайда фагоциттеуші лейкоциттер проценті 40 %-тен 80 %-ге дейін, ал 1 жасушаға қармалған бөлшектер саны 1ден 5ке дейін тербеледі.

Фагоциттеуші жасушалардың бактериоцидтілігінің жанама көрсеткіші ретінде жасуша цитоплазмасында күнгірт-көк формазан тұнбаларын түзе отырып, нитрокөк тетрозолий (НКТ) сары бояуын тотықсыздандыру қабілеті бойынша фагоциттердегі тотығу жарылысының интенсивтілігін алады. Фагоциттердегі тотығу жарылысы белсендірек болған сайын формазан тұнбасында жасушалар үлесі де көбірек болады. Жасушалардың санамағынан соң формазан-оңдарын процентте көрсетеді. Тотығу жарылысының индукторынсыз тек бояуы бар сау адам лейкоциттерін инкубациялағанда формозан оң жасушалардың үлесі 1-2 %-тен аспайды. Сау адам лейкоциттерін тотығу жарылысының индукторымен (фагоцитоз объектілері, бактериялық липополисахарид немесе полисахарид) бірге инкубациялағанда фагоцитердің барлық 100 %-тотығу жарылысымен және формазан тұнбасының жинақталуымен жауап беруі мүмкін. Формазан жасушалары үлесінің төмендеуі фагоциттердің бактериоцидтілігінің қышқылға тәуелді механизмінің ақаулығы туралы белгі береді.

2. Қандағы лимфоциттер мөлшерін анықтау әдістері. Лимфоциттерді пайымдау оларды қаннан бөліп алудан басталады. Мононуклеарлы лейкоциттерді (лимфоциттерді, моноциттерді) басқа жасушалардан (гранулоциттерден, эритроциттерден) айырып алу үшін арнайы қоспа препараттарын (фикол, ферографин) тығыздық градиентінде центрифугалау көмегіне жүгінеді. Вена қантамырынан алынған қанды антикоагулянтпен араластырады, аталған қоспасы бар түтікшеге ендіріледі де центрифугалайды. Үлкен тығыздыққа ие эритроциттер мен гранулоциттер түтікше түбінде тұнба түзеді, ал мононуклеарлы жасушалар градиентті қоспа беткейінде сақина түзеді. Оларды басқа түтікшеге ауыстырып, градиентті қоспадан тазартады.

Барлық жетілген лимфоциттердің морфологиясы бірдей болады: ядросы тығыз және цитоплазма белдемесі жіңішке кіші лимфоциттер. Лимфоциттер популяциясының және субпопуляциясының дифференциациясы сәйкес спецификалы антиденелердің көмегімен жасушалар антигендерінің әрбір типі үшін ерекше – беткейлік маркерлерді айқындаумен байланысты.

Шынайы жоюшыларда беткейлік маркер CD16 болады. Барлық Т-лимфоциттер беткейлік маркер CD3-ті алып жүреді (тотальді). Т-лимфоциттер субпопуляцияларға бөлінеді: Т-көмекшілерде CD4 маркері, ал цитотоксикалы Т-лимфоциттерде (CNL) CD8 маркері болады. В-лимфоциттер беткейлік мембраналарында флюоресценциялаушы антииммуноглобулинді антиденелердің (соның ішінде – иммуноглобулиндердің жекеленген изотиптеріне қарсы) көмегімен антиген ретінде анықталына алатын беткейлік иммуноглобулиндерді алып жүреді. Бұл беткейлік иммуноглобулиндер В-лимфоциттердің беткейлік маркерлері ретінде де қарастырылады.

Әртүрлі популяциялы мен субпопуляциялы лимфоциттерді беткейлік маркерлері бойынша анықтау екі әртүрлі нұсқалы әдістердің көмегімен жүргізіледі:

▪ флюорохроммен немесе ферментпен таңбаланған тұтас қанның немесе сәйкес

моноклональді антиденелермен өңделген мононуклеарлар қоспасының

жағындыларын люминесцентті немесе жарықтық микроскоппен көру;

▪ жасушаларды ағымдық цитофлюориметрді қолдана отырып автоматты түрде

санау (сурет 10.3.2).

Бірінші әдістемелік нұсқаны қолданған кезде жасуша беткейінде бояғышы бар антиденелер кешенінің көрінерлік тұнбасын алу маңызды. Бұл әдіс өте қажырлы әрі ұзақ. Осы әдіспен лимфоциттердің негізгі субпопуляциясының санын есептеу бір апатаға созылады. Ал ағымдық цитофлюориметрді пайдалана отырып автоматты түрде санауды қолдану бір-ақ күндік уақытты алады. Тұтас қанның үлгісін флюоресцентті бояғыштармен таңбаланған моноклональді антиденелермен бірге инкубациялайды да жіңішке түтікше арқылы өткізгенде тамшылар пайда болады. Олардың көбісінде бір ғана жасушадан болады. Әрбір тамшы лазер сәулесі алдынан өтеді. Егер тамшыда жасуша болса, жасуша лазер сәулесінің ауытқуын тудырады, ал лазаер сәулесі жасуша беткейінде антигенмен (беткейлік маркермен) байланысқан антидене молекуласындағы флюорохромның жарқырауын қоздырады. Сезімтал фотокөбейткіш екі сигналды да ұстайды: жарық шашырау жасушаның өлшемі мен гранулярлығы туралы ақпарат берсе, ал флюоресценция таңбаланған антиденелермен байланысқан жасушалар саны туралы, яғни беткейлік маркерлердің экспрессиясы туралы ақпарат береді. Әртүрлі флюорохромдармен (жасыл жарқырау беруші флюоресцеин мен қызыл жарқырау беруші фикоэритин) конъюгацияланған екі әртүрлі моноклональді антиденелерді қолданған жағдайда жекеленген жасушалар флюоресценцияның екі типінің интенсивтілігі бойынша бағаланады.

Жасушалардың үлкен мөлшерін зерттеу нәтижесінде (30 секундта 10 мың) компьютерлік өңдеуден соң аспап сәйкес беткейлік маркерлері (СD3, CD4, CD8, CD16, CD19 және т.б.) бар сол популяция жасушаларының проценті туралы санды мәлімет береді (кесте 10.3.1).

3. Лимфоциттер қызметін бағалау әдістері. Т-лимфоциттердің функциональді жетілгендігін едәуір кең тараған микробтық антигендерге (трихофитинге, кандидозды аллергенге, стрептококктық антигендерге, туберкулиндерге, дифтериялық анатоксиндерге) қатысты БТГС реакциясының интенсивтілігін көрсететін тері сынамалары көмегімен жанама бағалайды. Антигенді теріішілік енгізеді де 48 сағаттан соң БГТС реакциясының интенсивтілігін көрсететін инфильтрат – тығыздану диаметрін өлшейді.

Тыныштық күйдегі лимфоциттер қанда G0 фазасында циркуляцияланады. Лимфоциттердің маңызды функцияларының бірі нақты антигенді тануға жауап ретіндегі пролиферация болып табылады. Бірақ, бұл функцияны пайымдау мен бағалау үшін пролиферация индукторлары ретінде бейспецификалы поликлональді митогендерді қолданған ыңғайлы. Т-лимфоциттер үшін мұндай поликлональді митогендер болып өсімдіктік туындылы препараттар (бұршақтық өсімдіктерден алынған) саналады, В-лимфоциттер үшін – бактерия құрамалары: грамтеріс бактериялардың жасуша қабырғаларының липополисахаридтері мен стафилококктың А-протеині саналады. Поликлональді митогендердің активациясынан соң лимфоцит G1 фазасына тез енеді де бүкіл жасушалық циклден өтеді.