5.2.3. Сурет. Жасуша дақылындағы вирустар колониялары (теңбілдері)
а- ньюкаскл ауруы вирусының теңбілі; б- Коксаки вирусының теңбілі .
Тақырып 5.3. БАКТЕРИЯЛЫҚ ВИРУСТАРДЫ (ФАГТАРДЫ)
ДАҚЫЛДАУ ӘДІСТЕРІ МЕН ОЛАРДЫҢ ИНДИКАЦИЯСЫ
Кіріспе. Бактериялардың вирусы немесе бактериофагтар (фагтар), қоршаған ортада – су қоймаларында, топырақта кеңінен тараған. Ішек бактерияларының (ішек таяқшасының, шигеллалардың, сальмонеллалардың) фагтарын тоған сулар мен нәжістерден бөліп алуға болады. Стафилококктардың фагтары мұрын-жұтқыншақ кілегейінен, тері мен жарақат бөліндісінен, анаэробты жарақат инфекциясын тудырушы клостридия фагтары жарақат бөліндісінен, топырақтан табылып жатады. Бір ортада фагтың кездесуі сол жерде оған сезімтал бактерияның болуының айғағы.
Фагтар вирулентті және әлсіздеу болып бөлінеді. Вирулентті фагтар жаңа фагтық денешіктердің түзілуі мен бактериялық жасушалардың лизисімен аяқталатын өнімді инфекция тудырады.
Әлсіздеу фагтар өздері залалдаған жасушаларды лизиске ұшыратпайтын интегративті инфекция туғызады. Бұл фагтардың ДНҚ-сы бактерия хромосомасына тіркесіп, бактерия бөлінген сайын оның ұрпақтан ұрпағына тарайды. Фагтың жасушамен қарым-қатынасының мұндай типі лизогения, ал өз хромосомасында фагтық ДНҚ (профаг) бар бактерия лизогенді деп аталады. Лизогенді бактериялардың жасушасында әртүрлі факторлардың әсерінен профагтың индукциясының – оның ДНҚ-ның бактерия хромосомасынан үзіліп, өнімді инфекцияның дамуының жүріп кетуі мүмкін. Лизогенді фагтар табиғатта кеңінен тараған.
Бактериялардың сұйық ортада өсіп жатқан дақылының жасушаларындағы вирулентті фагтардың репродукциясы бактериялардың лизисін туындатады да ортаның саңлаулануына алып келеді. Фагтар Петри табақшасындағы тығыз қоректік ортада өсірілген сезімтал бактериялардың газонында концентрацияларына байланысты ошақтық немесе тұтастай лизис аймақтарын тудырады. Ошақтық лизис аймақтары фагтардың негативті колониялары, немесе стерильді дақтар – теңбілдер деген атқа ие болды (5.3.1. сурет). Олардың морфологиясы жекеленген фагтарға тән болып келеді және де бір фагтық денешіктің бактериялық жасушаға еніп әрі қарай сонда репродукциялануынан туындайды. Фагпен инфекцияланған әрбір бактерия лизистенеді де жүздеген жаңа фагтық денешіктерден тұратын сол фагтың ұрпағын босатып шығарады. Олар көрші жатқан жасушаға енеді де осы циклді қайталай береді. Жасушалардың лизисі нәтижесінде тұтастай бактериялық газонда фагтардың негативті колониялары пайда болады.
Сурет 5.3.1.. Бактериофагтардың негативті колониялары (стерильді дақтары).
а – Т2 фагының дақтары; б – Т1 фагының дақтары.
Фагтардың "таза" ұрпағын алу үшін (басқа фагтардың қоспасы жоқ) морфологиялық тұрғыда біртекті негативті фагтық колонияларды сол бір бактериялық штаммның газонында бірнеше рет қайта егу жүргізеді.
Көптеген фагтар бактерияға қатысты түрспецификалық қасиет көрсетеді. Бірақ, сол бактерия түрінің қайсыбір варианттарын ғана залалдайтын фагтар да кездеседі. Оларды сол түр ішінде фаготипті (фаговариантты) анықтау үшін қолданады. Сонымен қатар, бақтериялардың туыстас түрлерін де лизистеуші фагтар кездеседі. Тәжірибелік жұмыста фагтар мыналар үшін қолданылады:
а) бактерияларды фаготиптеуде, яғни бактериялардың сол бір түрінің штаммдарын типоспецификалық фагтармен лизистенуі бойынша фаготипті анықтау. Бұл аурулардың эпидемиологиялық талдамасы кезінде зерттелетін бактерияларды таңбалау үшін маңызды;
б) түрлік тегін айқындау мақсатында бактериялық дақылдарды фагоидентифи- кациялауда;
в) науқас организмінен (мысалы, нәжістен) фагты бөліп алумен шектелетін фагодиагностикада. Бұл материалда сәйкес бактерияның бар-жоқтығын жанама түрде айғақтайды.
г) фагопрофилактикада – эпидемиялық ошақта жүрген адамдар арасында қайсыбір аурулардың (мысалы, дизентерияның) алдын алуда.
д) фаготерапияда – мысалы, шигеллалардан, протеялардан, стафилококктардан туындаған қайсыбір инфекциялық ауруларды емдеуде.
▲ Әдістемелік нұсқаулар
Қоршаған орта объектілерінен фагтарды бөліп алу. Вирулентті фагты алу үшін бастапқы материалды (су, нәжіс суспензиясы және т.б.) бактериялық сүзгіден өткізе отырып, сүзінді дайындайды. Сүзіндіні сәйкес бактерия дақылымен бірге бульонға құйып, 18-24 сағатқа 37°С-қа инкубациялайды. Дақылдың лизисінен соң қалған бактериялық жасушаларды центрифугалау немесе бактериялық сүзгіден сүзу арқылы бөліп тастайды. Сүзіндідегі фагтың бар-жоқтығын сандық және сапалық әдістермен анықтайды.
E. coli фагтарын анықтаудың сапалық әдістері. Қоректік агары бар Петри табақшасына ішек таяқшасының тәуліктік сорпалық дақылын газон түрінде себеді де 10-15 минуттай 37°С-та кептіреді. Сонан соң, газон беткейіне жайылып ағатындай етіп фаг тамшысын ендіреді. Термостатта тәулік бойы инкубациялаған соң фаг тамшысы ізімен пайда болған лизис аймақтарына зейін қоя отырып, табақшаны қарап шығады.
Сандық әдіс – фаг титрін Грация әдісі бойынша анықтау. Тәжірибені жасау алдында атқарылатын жұмыстар: а) қоректік агарды Петри табақшасына құйып, термостатта кептіреді; б) дайындалып, 3-4 мл-ден шыны түтікшелерге құйылған жартылай сұйық (0,7%) қоректік агарды су моншасында жібітеді. Зерттелетін фагқа натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісінде 10 мәртелік сұйылту ( 10-2, - 10-7 ұйғарылған титрге байланысты) жүргізеді. Сонан соң фагтың соңғы (10-7) сұйылтпасынан 0,5 мл алып, сондай мөлшердегі фагқа сезімтал бактерияның тәуліктік сорпалық дақылымен араластырады да 45°С-қа дейін суытылған жартылай сұйық агары бар шыны түтікшеге құяды. Араласпаны дереу Петри табақшасындағы агар беткейіне құяды, ол осы жерде жұқа қабат түрінде қатып қалады. Осылайша фагтың келесі (10-6) сұйылтпасынан араласпа жасап, оны да агар беткейіне құяды. Одан соң осы жұмысты 10-5 сұйылтпамен қайталайды. Агардың екінші қабаты қатқан соң табақшаларды 37°С-та инкубациялайды да фагтың негативті колонияларын санайды. Бұл колониялардың саны себілген араласпадағы фагтар санына сәйкес келеді. Осыдан фагтың бастапқы суспензиясының 1 мл-дегі дақ түзуші бірлектерінің санын есептеп шығаруға болады. Фагтың концетрациясын сипаттаушы осы өлшем титр деп аталады. (5.3.1 кесте).
Фагтың лизистік әсерінің спектрін анықтау. Зерттелетін бактериялық дақылдардың саны бойынша қоректік агары бар Петри табақшасын квадраттарға сызып бөледі. әрбір квадратқа сәйкес сорпалық дақылдың тамшысын құрықпен ендіреміз де сол квадраттың аумағында оны жаямыз. Одан соң әрбір себілген квадратқа құрықпен немесе пастерлік тамызғышпен зерттелетін фагты бір тамшылап тамызамыз. Термостатта тәулік бойы инкубациялаған соң табақшаны қарап, бактериялық газондағы бактериялардың тұтастай лизисі немесе стерильді дақтары бар квадраттарды белгілейміз. Зерттелетін фагпен лизистенген сан-алуан бактериялық дақтар саныменен оның лизистік әсер спектрін анықтаймыз.