Умови проведення хроматографії

Час, хв	Рухома фаза А (%, V/V)	Рухома фаза Б (%, V/V)	Примітки
0-25	46	54	ізократичний режим
25-31	від 46 до 20	від 54 до 80	лінійний градієнт
31-37	20	80	ізократичний режим
37-40	від 20 до 46	від 80 до 54	лінійний градієнт
40-60	46	54	ізократичний режим, врівноважування колонки

- швидкість рухомої фази – 1 мл/хв;

- детектування при довжині хвилі 214 нм;

- температура колонки 40 °С;

- час проведення хроматографії 60 хвилин;

- співвідношення фаз А і Б (46/54) підбирають так, щоб час утримування піку гібридного білка на хроматограмі складав 25–30 хвилин.

Вміст гібридного білка (Х) в перерахунку на гібридний білок в міліграмах в 1 мл проби розраховують за формулами:

Х = (S₁×m₀)/S₁, (6.2)

де, S₁ – значення площі піку гібридного білка, розраховане з хроматограми випробовуваного розчину; S₀ – значення площі піку стандартного гібридного білка, розраховане з хроматограми розчину порівняння; m₀ – маса наважки стандартного гібридного білка, в міліграмах.

Результати аналізу вважаються достовірними, якщо виконуються вимоги тесту «Перевірка придатності хроматографічної системи».

Визначення оптичної щільності культури методом спектрофотометричного аналізу

Приготування зразка препарату: 1 мл розчину внести в мірну колбу місткістю 10 мл довести до мітки водою очищеною.

Одержаним зразком наповнюють кювету з товщиною шару 1 см. За допомогою спектрофотометра вимірюють оптичну густину зразка проти води очищеної при довжині хвилі 276 нм.

Концентрацію білка у зразку розрахувують за формулою:

С = А×0,961×Кр (г/л), (6.3)

де, С – концентрація білка, г/л; А – оптична густина зразка; 0,961 –поправочний коефіцієнт; Кр – коефіцієнт розведення зразка.

Вміст основної речовини в розчині розрахувують за формулою (9.4):

М = С×V, (6.4)

де, М – вміст основної речовини в розчині, г; С – концентрація білка у зразку, г/л; V – об’єм розчину, л.

6.3.3. Концентрація джерела вуглецю і азоту Визначення концентрації глюкози в культуральній рідині метод капілярного електрофорезу

Система капілярного електрофорезу серії «Капель» оснащена ультрафіолетовим детектором (254 нм) з наступними характеристиками:

- кварцовий капіляр, ефективною довжиною 0,5 м, внутрішнім діаметром 75×10^-6 м; провідний електроліт готують наступним чином: в суху скляну посудину з кришкою, що загвинчується поміщають 20 мг сорбату калію, 40 мг 10 % водного розчину цетил–триметиламонію–основного (ЦТА–ОН), 160 мг гліцерину (чистий для аналізу), додають 5 см³ дистильованої води і 0,08 см³ 1 % розчину гідроксиду калію;

- рекомендована негативна напруга –16 кВ, при цьому струм повинен становити 45 ± 2 мкА, тривалість аналізу 15 хвилин.

Пробопідготовку здійснюють наступним чином: пробу культуральної рідини розбавляють в 2–50 разів водою дистильованою (в залежності від очікуваної сумарної кількості глюкози), центрифугують 3–5 хвилин при 6000 об^-1, переносять в прилад і проводять дозування проби пневматичним методом під тиском 30 мБар протягом 5 секунд.

Орієнтовний час виходу глюкози становить 12,5 хвилин [52].