Приготування досліджувальних розчинів інсуліну

Номер пробірки	Кількість води, мкл	Кількість розчину інсуліну, мкл	Концентрація білку, мкг/мл
1	200	0	0
2	198	2	10
3	195	5	25
4	190	10	50
5	185	15	75
6	180	20	100
7	170	30	150
8	150	50	250

- вносять в кожну мікропробірку 1 мл розчину Бредфорда, закривають

пробірки і перемішати. Вимірювання проводять при довжині хвилі 595 нм, через 10 хвилин після перемішування. Отримані результати використати для побудови калібрувальної кривої.

Приготування зразка:

1 мл досліджуваного розчину вносять в мірну колбу місткістю 10 мл, довести до мітки водою очищеною. В мікропробірку вносять 197 мкл води і 3 мкл приготованого розчину, перемішати і використати для визначення концентрації гібридного білка (С, мкг/мл).

Вносять в мікропробірку 1 мл розчину Бредфорда, закривають пробірку і перемішують. Вимірювання проводять при довжині хвилі 595 нм, через 10 хвилин після перемішування. Для встановлення нульового значення базового поглинання необхідно змішати в пробірці 1 мл реактива Бредфорда з 200 мкл води. Значення оптичної густини повинно бути від 0,1 до 1,0. Після вимірювання промити кювету 70 % розчином етанолу.

Визначають концентрацію гібридного білка за калібрувальною кривою. Концентрація відновленого гібридного білка (С_v) розраховується по формулі:

С_v= (С×0,2×10⁴)/ 3×10³, (6.1)

де С – концентрація гібридного білка, мг/мл.

Отриманий результат помножити на об’єм гібридного білка (в літрах) – для отримання маси відновленого білка (в грамах).

Визначення вмісту рефолдованого гібридного білку методом верх

Приготування випробуваних розчинів: 2 проби рефолдованого гібридного білка по 1 мл розчину без розведення; 1 мл розчину вносять в мірну колбу місткістю 10 мл, доводять до мітки водою очищеною.

Приготування рухомої фази А:

1350 мл буферного розчину з рН 2,3 поміщають в мірну склянку місткістю 2000 мл і додають 150 мл ацетонітрилу. Після змішування доводять рН рухомої фази до значення 2,3 (потенціометр) кислотою ортофосфорної концентрованою.

Термін придатності рухомої фази 1 місяць.

Приготування рухомої фази Б

600 мл буферного розчину з рН 2,3 поміщають в мірну склянку місткістю 2000 мл, додають 900 мл ацетонітрилу. Після змішування доводять рН рухомої фази до значення 2,3 (потенціометр) кислотою ортофосфорной концентрованою.

Термін придатності рухомої фази 1 місяць.

Приготування буферного розчину з рН 2,3:

6,75 мл кислоти ортофосфорної концентрованої і 42,1 г натрію перхлорату поміщають в мірну колбу місткістю 2000 мл, додають 1600 мл води і доводять рН розчину до значення 2,3 (потенціометр) за допомогою розчину триетиламіну. Доводять об’єм розчину водою до мітки і перемішують.

Термін придатності розчину 1 місяць.

Перевірка придатності хроматографічної системи:

Хроматографічна система вважається придатною, якщо виконуються наступні умови:

- ефективність хроматографічної колонки, розрахована по піку стандартного гібридного білка на хроматограмах розчину порівняння, повинна бути не менше 2000 теоретичних тарілок;

- відносне стандартне відхилення, розраховане для площ піку стандартного гібридного білка на хроматограмах розчину порівняння і для піку зразка препарату гібридного білку на хроматограмах випробовуваного розчину повинне бути не більше 2,0 % кожного;

- коефіцієнт симетрії піку, розрахований по піку стандартного гібридного білка на хроматограмах розчину порівняння повинен бути не більше 1,8.

Розчин порівняння:

Наважку 2 мг стандартного рефолдованого гібридного білку поміщають в мірну колбу місткістю 20 мл, розчиняють в 2,0 мл 0,01 М розчину кислоти хлористоводневої. Об’єм доводять до мітки водою очищеною, перемішують.

По 0,02 мл досліджуваного розчину і розчину порівняння хроматографують на рідинному хроматографі Waters 600 з UV/VIS детектором Waters 486, одержуючи хроматограми для кожного з розчинів, в наступних умовах:

- колонка сталева розміром 4,6 мм×250 мм, заповнена сорбентом DAISOPAK SP–120–5–ODS–AP з розміром частинок 5мкм;

- рухома фаза А: буферний розчин – 2, рН 2,3 – ацетонітріл (9:1), дегазована будь–яким зручним способом;

- рухома фаза Б: буферний розчин – 2, рН 2,3 – ацетонітріл (2:3), дегазована будь–яким зручним способом;

- використовується наступна програма градієнту (табл. 9.3):

Таблиця 6.3