6.3.2. Концентрація цільового продукту Визначення гібридного білка методом електрофорезу в поліакриламідному гелі (пааг)

Електрофорез проводять з використанням електрофоретичної системи Fisher Scientific, Dual Gel Protein Electrophoresis System, Model FB–VE20–1 при постійному струмі (135 В, 0,03 A).

Приготування зразка для електрофоретичного аналізу:

Необхідно внести 100 мкл розчину гібридного білка в мікроцентрифужну пробірку та осадити клітини центрифугуванням, з прискоренням 10000 g протягом 1 хвилини. Далі злити супернатант, клітини ресуспендувати в 50 мкл буфера (100 мM Tris–HCl (pH 6,8), 200 мM β–меркаптоетанолу, 1 % SDS; 20 % гліцерин; 0,01 % бром феноловий синій). Зразок помістити на 5 хвилин в киплячу водяну баню, після чого центрифугувати протягом 5 хв при значенні прискорення – 10000 g.

Приготування електрофоретичної пластини:

готують гелеві пластини згідно інструкції фірми виробника.

Необхідно приготувати 30 мл розчину для розділюючого гелю наступного складу: 15 % акриламід; 0,4 % біс–акриламід; 375 мM Tris–НCl (pH 8,8); 0,1 % SDS; 0,1 % персульфат амонію (PSA); 0,08 % TEMED. Розчин ТЕМЕD вноситься безпосередньо перед заливанням розчину між гелевими пластинами як каталізатор полімеризації акриламіду.

Далі поміщають приготований розчин між гелевими пластинами та залишають на 15–20 хвилин до повної полімеризації гелю.

Встановлюють гребінку між гелевими пластинами та вносять приготований розчин. Після полімеризації концентруючого гелю видаляють

гребінку та промивають сформовані комірки водою.

Проведення електрофоретичного розділення:

Встановлюють гелеву пластину в камеру електрофоретичної системи та заповнити камеру буфером для електрофорезу: 25 мM Tris; 250 мM гліцин; 0,1 % SDS. Внесять в комірки приготовані зразки гібридного білка та зразок маркера білків різної молекулярної маси. Підключають камеру до джерела струму. Проводять електрофоретичне розділення до досягнення бромфеноловим синім краю гелевої пластини.

Візуалізація гібридного білка на гелі:

Розділяють гелеві пластини та обережно перенесять гель в контейнер, що містить розчин для фарбування: 45 % метанолу; 10 % кислоти оцтової; 0,25 % барвника Coomassie Blue R250. Інкубують щільно закритий контейнер в термостаті (60 °С) протягом 1 години.

Після фарбування відмивають гель до знебарвлення фону розчином 5 % метанолу; 7 % кислоти оцтової. Проводять детекцію гібридного білка, що повинен складати найбільш інтенсивну забарвлену зону на рівні молекулярної маси 12 кДа. хїїїїї

Визначення концентрації білка методом Бредфорда

Приготування розчину Бредфорду:

В 840 мл води внесять 100 мг барвника Coomassie Blue G–250 (0,01 %), 59 мл 95 % етанолу (4,7%), і 100 мл 85 % ортофосфорної кислоти (8,5 %). За допомогою магнітної мішалки перемішують до повного розчинення кристалів барвника Coomassie Blue.

Отриманий розчин фільтрують через Whatman 3M фільтр, щоб звільнитися від нерозчинених частинок. Розчин можна зберігати протягом двох тижнів при кімнатній температурі. Альтернативно можна використовувати комерційний розчин Бредфорда виробництва Sigma або Merck.

Побудова калібрувальної кривої:

- на аналітичних вагах зважують 10 мг інсуліну людини;

- перенесять наважку інсуліну людини в мірну колбу, місткістю 10 мл;

- вносять в колбу 5 мл 0,1 М кислоти хлористоводневої, перемішують

до повного розчинення білку. Внесять в колбу 5 мл 1 М фосфатного буферу;

- необхідно приготувати в окремих мікропробірках по 200 мкл розчину інсуліну, що містить: 0 мкг, 2 мкг, 5 мкг, 10 мкг, 15 мкг, 20 мкг, 30 мкг, 50 мкг білку по наведеній схемі (табл. 6.2):

Таблиця 6.2