6. Мікробіологічний контроль

6.1.Методика змиву з поверхні

Для визначення санітарано–мікробіологічного стану поверхонь приміщень та обладнання проводять змив з поверхні відповідної площі. Змив здійснюється, за допомогою простерилізованого в розчині спирту етилового трафарету із заданою площею рамки (100 см²).

Трафарет прикладається до відповідної контрольованої ділянки поверхні; далі стерильним та змоченим у воді дистильованій тампоном проводять змив з поверхні. В стерильних умовах – біля полум’я спиртівки, вносять тампон у колбу з водою дистильованою, занурюючи його повністю.

Після цього стерильною піпеткою відбирають відповідний об’єм води із колби та переносять пробу у чашку Петрі з поживним середовищем. Інкубацію проводять при температурі 37 °C впродовж 2 діб. Після чого підраховують кількість КУО відповідно враховуючи всі площі поверхонь.

6.1. Ідентифікація штаму-продуцента

Ідентифікація Е. сoli здійснюється шляхом відбору проб кожну годину після початку вирощування посівного матеріалу та виробничого біосинтезу.

Культуральну рідину, об’ємом 0,1 мл відбирають на предметне скло та готують препарат «роздавлена крапля». Після цього проводять мікроскопіювання зразка. При цьому Е. сoli має такі морфолого–культуральні ознаки: клітини дрібні, палочкоподібної форми; за Грамом фарбуються негативно; неспороносні; мають розмір 1×3,5 мкм; рухливі; мають добре помітні тільця включення після індукції синтезу гібридного білка; край колонії рівний, діаметр колоній 1–3 мм.

Одним з методів ідентифікації мікроорганізму, являється метод висівання даного штама–продуцента на диференційно–діагностичне поживне середовище. Для ідентифікації продуцента Е. coli JM109/pPINS07 використовується поживне середовище Ендо наступного складу:

- живильний агар сухий – 26,5 г;

- ЕКДА – 1,22 г;

- динатрію гідрофосфат – 0,48 г;

- натрію сульфіт безводний – 0,83 г;

- натрію карбонат – 0,03 г;

- лактоза – 10,7 г;

- фуксин основний – 0,23 г;

- вода очищена – 1000 мл [24].

Відбирають культуральну рідину, об’ємом 0,1 мл та засівають нею підготовлене поживне середовище в чашці Петрі; інкубують впродовж 18 годин при температурі 36 °С. Ріст характерних малинових колоній з металевим блиском або без нього або рожевих колоній, діаметром від 2 до 4 мм вказує на те, що мікроорганізм, який інкубувався є Е. coli.

6.3. Показники росту і синтезу цільового продукту

6.3.1. Концентрація біомаси

Контроль концентрації біомаси здійснюють методом спектрофотометрії, яка заснована на вивченні спектрів поглинання в різних областях спектра.

Випробовуваний розчин: 1 мл культуральної рідини.

Приготування зразка препарату: 1 мл чистого посівного матеріалу (клітини штаму–продуцента) вносять в поліпропіленову пробірку місткістю 50 мл, додають 49 мл чистого поживного середовища.

Наповнюють стандартну кювету (довжина оптичного шляху 10 мм) чистим поживним середовищем (відібраним перед засівом). При довжині хвилі λ=600 нм, корегуюють значення оптичного поглинання середовища як базове.

Наповнюють кювету досліджуваним зразком культуральної рідини та вимірюють оптичну густину при довжині хвилі 600 нм. ять

Вимірювання проводять кожну годину після початку виробничого біосинтезу. Біосинтез вважається завершеним, коли значення вимірюваної оптичної густини становить до 10 одиниць.