- •Кузьмина Наталья Александровна
- •Раздел 1. Промышленная биотехнология
- •Раздел 2. Культуры растительных клеток
- •Раздел 3. Культуры животных клеток и тканей
- •Раздел 4. Генетическая инженерия
- •Промышленная биотехнология Основные направления биотехнологии
- •Основные типы биопроцессов Производство биомассы
- •Получение спиртов и полиолов
- •Производство вторичных метаболитов
- •Микробные биотрансформации
- •Производство ферментов
- •Аминокислоты,органические кислоты, витамины и другие биопродукты
- •Биоконверсия лигноцеллюлозных отходов
- •Объекты биотехнологии и их биотехнологические функции Бактерии и цианобактерии
- •Простейшие
- •Водоросли
- •Растения
- •Перспективы развития биотехнологии
- •Стадии биотехнологического производства
- •Технология приготовления питательных сред для биосинтеза
- •Поддержание чистой культуры и получение засевной дозы
- •Ферментация
- •Общие принципы разделения веществ
- •Методы тонкой очистки и разделения препаратов
- •Основные принципы промышленного осуществления биотехнологических процессов Получение товарных форм препаратов
- •Продуценты белка
- •Субстраты для получения белка
- •Технология получения микробных липидов
- •Технология ферментных препаратов Ферменты, получаемые промышленным способом, их применение
- •Глубинный метод культивирования продуцентов ферментов
- •Поверхностный метод культивирования продуцентов ферментов
- •Биотехнология препаратов для сельского хозяйства Бактериальные энтомопатогенные препараты
- •Ехнология получения грибных энтомопатогенных препаратов
- •Технология получения вирусных энтомопатогенных препаратов
- •Технология производства бактериальных удобрений на основе клубеньковых бактрий
- •Бактериальные удобрения. Технология получения азотобактерина
- •Бактериальные удобрения. Технология получения фосфобактерина
- •Антибиотики для сельского хозяйства
- •Иммобилизованные ферменты Общая характеристика
- •Иммобилизованные ферменты Носители для иммобилизованных ферментов
- •Методы иммобилизации ферментов
- •Применение иммобилизованных ферментов
- •Иммобилизованные клетки микроорганизмов
- •Биотехнология и экологические проблемы Биодеградация ксенобиотиков
- •Общие принципы очистки сточных вод: аэробные системы очистки
- •Общие принципы очистки сточных вод: анаэробные системы очистки
- •Показатели загрязненности сточных вод
- •Промышленная биотехнология Литература к разделу
Ехнология получения грибных энтомопатогенных препаратов
Энтомопатогенные препараты на основе микроскопических грибов вызывают у насекомых микозы. Грибы обладают рядом особенностей:
- поражение происходит через кутикулу;
- насекомые поражаются в фазе развития куколки и имаго;
- большая скорость роста и огромная репродуктивная способность, в виде спор могут длительное время находится в природе без снижения энтомопатогенной активности;
- высокая специфичность, вирулентность сильно зависит от штамма гриба.
Действие грибного препарата на насекомое начинается с проникновения споры в полость тела через кожные покровы. Попав в тело, спора прорастает в гифу, затем разрастается мицелий, от которого отчленяются конидии. Оказавшись в теле, конидии циркулируют в гемолимфе. Уже на этой стадии возможно поражение насекомого вследствие выделения некоторыми штаммами значительного количества токсинов. В отсутствие токсина мицелий постепенно заполняет все тело насекомого, прежде всего поражается мышечная ткань. Рост гриба продолжается до тех пор, пока все ткани не будут разрушены. Могут образовываться конидиеносцы, прорывающие кутикулу и обволакивающие мертвую личинку.
В промышленном производстве используются отдельные штаммы в основном трех родов: Beaveria, Metarrhizium, Entomophtora. В нашей стране освоено промышленное производство препарата боверина на основе B.bassiana. Готовый препарат - порошок кремового или белого цвета, содержащий в 1 г от 1.5 до 6 млрд. конидиоспор. Препарат безвреден для теплокровных животных и человека, не вызывет ожогов у растений.
Получать боверин можно используя как поверхностное, так и глубинное культивирование. Первый способ более трудоемок и длителен, поэтому имеет ограниченное значение. Производство конидиоспор при выращивании его в жидкой среде также непростая задача. Основная трудность в том, что при этом способе культивирования гриб размножается вегетативно, образуя гонидии. Гонидии по вирулентности не уступают конидиям, однако неустойчивы к высоким температура на стадии высушивания. При традиционной распылительной сушке погибает 90% гонидиоспор и 20-50% конидиоспор. Проблема решается подбором питательной среды и условий ферментации, обеспечивающих переход 90% выращенных клеток в конидиоспоры.
Технология получения боверина методом глубинного культивирования включает обычные стадии. Питательная среда содержит в процентах: дрожжи кормовые - 2, крахмал - 1, хлорид натрия - 0.2, хлорид марганца - 0.01, хлорид кальция - 0.05. Последний компонент обеспечивает устойчивость конидий к неблагоприятным факторам, поэтому его содержание может сильно варьировать (до 5%). Культивируют при рН 4.5-5.6, температуре 25-28оС 3-4 суток в условиях постоянного перемешивания и аэрации. В среде необходимо также наличие аминного азота, так как его недостаток снижает скорость роста культуры и процент образования конидиоспор, избыток ведет к образованию гонидий. Культуральную жидкость подвергают сепарации и фильтрованию, после чего пасту сушат на распылительной сушке.
Технология получения вирусных энтомопатогенных препаратов
Из всех энтомопатогенных препаратов вирусные обладают наибольшей специфичностью по отношению к насекомому-хозяину. Они поражают не более одного вида. Их ярко выраженная специфичность обуславливает практическую безвредность вирусных препаратов для человека, флоры и фауны.
Вирусы отличает высокая устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды, они способны сохранять активность в течение 10-15 лет, находясь вне насекомого. Заражение вирусом происходит при питании вредителя. Попавшие в кишечник тельца-включения при щелочных значениях рН разрушаются. Освобожденные вирионы проникают через стенку кишечника в клетки, где в ядрах происходит репликация вирусов. Высвободившиеся вирусы заражают другие клетки, что в итоге приводит к гибели насекомого. Отличительной особенностью вирусов является то, что они могут размножаться только в живой ткани. Это создает определенные трудности в организации промышленного производства, так как технология размножения вирусов должна быть связана с использованием живых насекомых-хозяев.
В нашей стране осуществляется выпуск трех вирусных энтомопатогенных препаратов: вирин-ЭКС (против капустной совки), ЭНШ (против непарного шелкопряда) и АББ (против американской белой бабочки).
Производство любого из вирусных препаратов начинают с разведения насекомого-хозяина на искусственных питательных средах, обеспечивающих их физиологически здоровое состояние. На определенной стадии развития ( обычно на стадии гусеницы) насекомых заражают, добавляя вирусную суспензию к корму. При этом инокулят предварительно получают от нескольких больных личинок. После заражения насекомых выдерживают в строго определенных условиях, обеспечивающих максимальное накопление вируса в тканях. Через 7-9 суток собирают мертвые и отмирающие личинки, подсушивают при температуре 33-35оС, измельчают механическим способом для вывода телец-включений из тканей. К полученной массе добавляют физиологический раствор или дистиллированную воду из расчета 1 мл на гусеницу, взвесь полученных тканей фильтруют.
При производстве вирин-ЭКС полиэдры осаждают из фильтрата центрифугированием. Осадок суспендируют в минимальном количестве дистиллированной воды и добавляют простерилизованный глицерин до титра 1 млрд. полиэдров в 1 мл. Готовый препарат разливают во флаконы. При производстве вирин-ЭНШ в фильтрат добавляют лактозу, а после перемешивания ацетон в соотношении 4:1 к объему суспензии. После отстаивания надосадочную жидкость сливают, осадок подсушивают до полного удаления ацетона. Если препарат планируется выпускать в виде порошка, то сухой осадок смешивают с мелкодисперсным наполнителем (каолином, например) до получения титра полиэдров 1 млрд. полиэдров в 1 грамме.
Масляную форму препарата получают путем диспергирования осадка в стерильном 50% растворе глицерина до титра 2 млрд. полиэдров в 1 мл, а затем добавляют равный объем солярового масла, перемешивают и разливают по флаконам. Вирусные энтомопатогенные препараты применяют путем внесения полиэдров в плотные популяции насекомых-вредителей с целью возникновения в них эпизоотий. Данный способ обработки предполагает внесение небольших количеств препарата. В другом случае опрыскивание или опыление производят на зараженных участках в период рождения личинок или на ранних стадиях их развития.