Раздел 3. Культуры животных клеток и тканей

Глава "Культивирование клеток":

История метода

Введение клеток в культуру, их происхождение

Характеристика клеток, культивируемых in vitro

Питательные среды и условия культивирования

Системы культивирования клеток

Использование культуры клеток человека

Культивирование клеток и тканей беспозвоночных

Глава"Культивирование органов":

Глава"Гибридизация животных клеток":

История метода

Методы создания экспериментальных химер

Механизм слияния клеток

Глава"Моноклональные антитела":

Функциональная структура антител

Получение моноклональных антител

Методы анализа на основе моноклональных антител

Применение моноклональных антител

Глава "Клонирование животных ":

История клонирования

Методы трансплантации ядер

Клонирование млекопитающих

Глава "Регулирование воспроизводства сельскохозяйственных животных"

Литература к разделу 3

Презентация о получении химерных мышей

 

Раздел 4. Генетическая инженерия

Глава "Введение в генетическую инженерию":

Возможности генной инженерии

Генная инженерия как наука, методы

История генетической инженерии

Глава "Ферменты генетической инженерии":

Основные группы

Рестриктазы

Полимеразы

Обратная транскриптаза

Лигазы

Изменяющие структуру концов фрагментов ДНК

Глава "Классификация, номенклатура и характеристика рестриктаз":

Классификация рестриктаз

Номенклатура и характеристика рестриктаз

Механизм действия рестриктаз

Глава "Построение рестрикционных карт"

Глава "Конструирование рекомбинантных ДНК"

Глава "Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК"

Глава "Гибридизация как высокочувствительный метод выявления специфических последовательностей нуклеотидов"

Глава "Методы клонирования ДНК":

Клонирование ДНК in vivo.

Геномные библиотеки и библиотеки кДНК

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Применение ПЦР

Глава "Введение гена в клетку":

Требования к векторной ДНК, ее состав.

Гены - маркеры.

Регуляция экспрессии генов прокариот

Типы векторов

Способы прямого введения генов

Генетические манипуляции с бактериальными клетками

Глава "Введение генов в клетки млекопитающих":

Характеристика векторов для переноса генов в животные клетки

Генетическая транформация соматических клеток млекопитающих

Генотерапия

Получение трансгенных животных

Глава "Генная инженерия растений":

Трансформация растительного генома - регуляторные элементы

Введение генов в растительные клетки

Экспрессия генетического материала в трансгенных растениях

Характеристика Ti- и Ri-плазмид

Генетическая трансформация растений с помощью Ti- и Ri-плазмид

Достижения генной инженерии растений

Проблемы биобезопасности трансгенных растений

Литература по генной инженерии 4

Промышленная биотехнология Основные направления биотехнологии

Условно можно выделить следующие основные направления биотехнологии: биотехнология пищевых продуктов, препаратов для сельского хозяйства, препаратов и продуктов для промышленного и бытового использования, лекарственных препаратов, средств диагностики и реактивов, биотехнология также включает выщелачивание и концентрирование металлов, защиту окружающей среды от загрязнения, деградацию токсических отходов и увеличение добычи нефти.

 Биоэнергетика

Растительный покров Земли составляет более 1800 млрд. т сухого вещества, что энергетически эквивалентно известным запасам энергии полезных ископаемых. Леса составляют около 68% биомассы суши, травяные экосистемы - примерно 16%, а возделываемые земли - только 8%.

Для сухого вещества простейший способ превращения биомассы в энергию заключается в сгорании - оно обеспечивает тепло, которое в свою очередь превращается в механическую или электрическую энергию. Что же касается сырого вещества, то в этом случае древнейшим и наиболее эффективным методом превращения биомассы в энергию является получение биогаза (метана).

Метановое «брожение», или биометаногенез, - давно известный процесс превращения биомассы в энергию. Он был открыт в 1776 г. Вольтой, который установил наличие метана в болотном газе. Биогаз, получающийся в ходе этого процесса, представляет собой смесь из 65% метана, 30% углекислого газа, 1% сероводорода (Н₂S) и незначительных количеств азота, кислорода, водорода и закиси углерода. Болотный газ дает пламя синего цвета и не имеет запаха. Его бездымное горение причиняет гораздо меньше неудобств людям по сравнению со сгоранием дров, навоза жвачных животных или кухонных отбросов. Энергия, заключенная в 28 м³ биогаза, эквивалентна энергии 16,8 м³ природного газа, 20,8 л нефти или 18,4 л дизельного топлива.

Биометаногенез осуществляется в три этапа: растворение и гидролиз органических соединений, ацидогенез и метаногенез. В энергоконверсию вовлекается только половина органического материала—1800 ккал/кг сухого вещества по сравнению с 4000 ккал при термохимических процессах, но остатки, или шлаки, метанового «брожения» используются в сельском хозяйстве как удобрения. В процессе биометаногенеза участвуют три группы бактерий. Первые превращают сложные органические субстраты в масляную, пропионовую и молочную кислоты; вторые превращают эти органические кислоты в уксусную кислоту, водород и углекислый газ, а затем метанообразующие бактерии восстанавливают углекислый газ в метан с поглощением водорода, который в противном случае может ингибировать уксуснокислые бактерии. В 1967 г. Брайант и др. установили, что уксуснокислые и метанообразующие микроорганизмы образуют симбиоз, который ранее считался одним микробом и назывался Methanobacillus omelianskii.

Для всех метанобактерий характерна способность к росту в присутствии водорода и углекислого газа, а также высокая чувствительность к кислороду и ингибиторам производства метана. В природных условиях метанобактерии тесно связаны с водородобразующими бактериями: эта трофическая ассоциация выгодна для обоих типов бактерий. Первые используют газообразный водород, продуцируемый последними; в результате его концентрация снижается и становится безопасной для водородобразующих бактерий.

 Метановое «брожение» происходит в водонепроницаемых цилиндрических цистернах (дайджестерах) с боковым отверстием, через которое вводится ферментируемый материал. Над дайджестером находится стальной цилиндрический контейнер, который используется для сбора газа; нависая над бродящей смесью в виде купола, контейнер препятствует проникновению внутрь воздуха, так как весь процесс должен происходить в строго анаэробных условиях. Как правило, в газовом куполе имеется трубка для отвода биогаза. Дайджестеры изготовляют из глиняных кирпичей, бетона или стали. Купол для сбора газа может быть изготовлен из нейлона; в этом случае его легко прикреплять к дайджестеру, изготовленному из твердого пластического материала. Газ надувает нейлоновый мешок, который обычно соединен с компрессором для повышения давления газа.

В тех случаях, когда используются отходы домашнего хозяйства или жидкий навоз, соотношение между твердыми компонентами и водой должно составлять 1:1 (100 кг отходов на 100 кг воды), что соответствует общей концентрации твердых веществ, составляющей 8—11% по весу. Смесь сбраживаемых материалов обычно засевают ацетогенными и метаногенными бактериями или отстоем из другого дайджестера. Низкий рН подавляет рост метаногенных бактерий и снижает выход биогаза; такой же эффект вызывает перегрузка дайджестера. Против закисления используют известь. Оптимальное «переваривание» происходит в условиях, близких к нейтральным (рН 6,0—8,0). Максимальная температура процесса зависит от мезофильности или термофильности микроорганизмов (30—40° С или 50—60° С); резкие изменения температуры нежелательны.

Обычно дайджестеры загружают в землю, чтобы использовать изоляционные свойства почвы. В странах с холодным климатом их нагревают при помощи устройств, которые применяют при компостировании сельскохозяйственных отходов. С точки зрения питательных потребностей бактерий избыток азота (например в случае жидкого навоза) способствует накоплению аммиака, который подавляет рост бактерий. Для оптимальной переработки соотношение C/N должно быть порядка 30:1 (по весу). Это соотношение можно изменять, смешивая субстраты, богатые азотом, с субстратами, богатыми углеродом. Так, C/N навоза можно изменить добавлением соломы или жома сахарного тростника.

Отходы пищевой промышленности и сельскохозяйственного производства характеризуются высоким содержанием углерода (в случае перегонки свеклы на 1 л отходов приходится до 50 г углерода), поэтому они лучше всего подходят для метанового «брожения», тем более, что некоторые из них получаются при температуре, наиболее благоприятной для этого процесса. Желательно перемешивать суспензию сбраживаемых веществ, чтобы воспрепятствовать расслаиванию, которое подавляет брожение. Твердый материал необходимо раздробить, так как наличие крупных комков препятствует образованию метана. Обычно длительность переработки навоза крупного рогатого скота составляет две—четыре недели. Двухнедельной переработки при температуре 35° С достаточно, чтобы убить все патогенные энтеробактерии и энтеровирусы, а также 90% популяции Ascaris lumbricoides и Ancylostoma.

Конференция ООН по науке и технике для развивающихся стран (1979) и эксперты Экономической и социальной комиссии по странам Азии и Тихого океана подчеркнули достоинства интегрированных сельскохозяйственных программ, использующих биогаз. Такие программы направлены на разработку пищевых культур, а также на производство белка культурами водорослей, создание рыбных ферм, переработку отходов и превращение различных отбросов в удобрения и энергию в виде метана. Надо отметить, что 38% от 95-миллионного поголовья крупного рогатого скота в мире, 72% остатков сахарного тростника и 95% отходов бананов, кофе и цитрусовых приходятся на долю стран Африки, Латинской Америки, Азии и Ближнего Востока. Не удивительно, что в этих регионах сосредоточены огромные количества сырья для метанового «брожения». Следствием этого явилась ориентация некоторых стран сельскохозяйственно ориентированной экономикой на биоэнергетику. Например, одним из основных принципов энергетической политики Индии является производство биогаза в сельских районах. В конце 1979 г. в Индии работало менее 100 000 установок. В Китае в этот же период насчитывалось 10 млн. установок. Сырьем для загрузки установок в этих странах являются отходы животноводческих ферм и птицефабрик. В Центральной Америке построены установки, работающие на отходах производства кофе. В Масатенанго была построена фабрика, выпускающая 90 м³ биогаза в сутки и 900 т органических удобрений в год из отходов кофе. Биогаз обеспечивает работу двигателя мощностью 35 л. с., являющегося частью устройства, которое лущит кофе со скоростью 3 т/ч, вырабатывает 1500 В электроэнергии и обеспечивает работу компрессора. В Израиле с 1974 г. производством биогаза занимается «Ассоциация киббуци индастриз» (KIA). Проведены фундаментальные исследования процесса метаногенеза при активном участии нескольких университетов и промышленных исследовательских институтов под эгидой министерства энергетики. Анаэробное брожение происходит при 55° С. Исследователям удалось добиться повышения выхода биогаза до 4—6,5 м3 в сутки на каждый кубометр объема цистерны дайджестера (что в десять раз превышает обычный выход). Биогаз состоит из 62% метана и 38% углекислого газа; последний предполагают использовать в теплицах для ускорения фотосинтеза культивируемых растений. Отходы переработки, содержащие только 12% твердого вещества, скармливают рыбам. Это помогло сэкономить половину гранулированных кормов из злаков, которые обычно употребляют при разведении рыб. Как показали эксперименты, богатые белками, минеральными солями и витаминами отходы крупного рогатого скота и овец можно использовать в качестве корма для скота, заменяя ими до 25% сухого вещества поглощаемой пищи.

 Производство биогаза путем метанового «брожения» отходов — одно из возможных решений энергетической проблемы в большинстве сельских районов развивающихся стран. И хотя при использовании коровьего навоза только четверть органического материала превращается в биогаз, последний выделяет тепла на 20% больше, чем его можно получить при полном сгорании навоза.

Производство биогаза имеет следующие достоинства: это источник энергии, доступный на семейном и общинном уровне; отходы процесса служат высококачественными удобрениями и в довершение сам процесс способствует поддержанию чистоты окружающей среды. Чтобы обеспечить крупномасштабное развитие и экономическую выгоду предприятий по производству биогаза, необходимо решить целый ряд биохимических, микробиологических и социальных проблем. Усовершенствования касаются следующих областей: сокращения числа стальных элементов в используемом оборудовании; создания оборудования с оптимальной конструкцией; разработки эффективных нагревателей; нагрева дайджестеров за счет солнечной энергии; объединения систем производства биогаза с другими нетрадиционными источниками энергии; конструирования крупномасштабных производственных единиц для сельских или городских общин; оптимального использования переработанных отходов и, наконец, усовершенствования процессов брожения и начальной деградации отходов.

Биотехнология в состоянии внести крупный вклад в решение проблем энергетики посредством производства достаточно дешевого биосинтетического этанола, который кроме того является и важным сырьем для микробиологической промышленности при получении пищевых и кормовых белков, а также белково-липидных кормовых препаратов.

Источником углеводородов также могут служить водоросли. У широко распространенной зеленой водоросли Botryococcus braunii (обитающей в пресной и солоноватой воде умеренных и тропических зон) углеводороды в зависимости от условий роста и разновидностей могут составлять до 75% сухой массы. Они накапливаются внутри клеток, и водоросли, в которых их много, плавают на поверхности. После сбора водорослей эти углеводороды легко отделить экстракцией каким-нибудь растворителем или методом деструктивной отгонки. Таким путем может быть получено вещество, аналогичное дизельному топливу и керосину.

Встречается несколько разновидностей B.braunii, отличающихся пигментацией и структурой синтезируемых углеводородов. Зеленая разновидность содержит линейные углеводороды с нечетным (25-31) числом атомов углерода, бедных двойными связями. Красная водоросль содержит углеводороды с 34-38 атомами углерода и несколькими двойными связями; это так называемые "ботриококкцены". Смысл существования двух разновидностей в настоящее время изучается. Углеводороды накапливаются в клеточной стенке, их синтез связан с метаболической активностью водоросли в фазе роста. Выход углеводородов при создании оптимальных условий культивирования может достигать 60 т/га/год для культуры водорослей, выращиваемой в толще воды в природных или искусственных условиях. Для определения перспективности использования B.braunii необходимо провести следующие исследования:

- определить условия, обеспечивающие максимальную скорость роста и образования углеводов в лабораторных и полевых условиях;

- выяснить, можно ли добиться скорости роста B.braunii, сопоставимой с известной для других водорослей;

- разработать соответствующие методы выращивания, сбора и переработки;

- оценить применимость получаемого продукта как альтернативного источника топлива и смазочных веществ. Исследования, связанные с выделением и возможностью утилизации углеводородов B.braunii, могут также способствовать лучшему пониманию вопроса о происхождении нефти.

 Биотехнология обработки стоков и контроль загрязнения воды тяжелыми металлами

Развитие промышленности ведет к образованию большого количества отходов, в том числе отходов, содержащих новые антропогенные компоненты. Методами биотехнологии эти отходы могут быть переработаны в полезные или безвредные продукты.

Бытовые отходы делятся на 2 группы: твердые отходы и сточные воды.

Твердые бытовые отходы состоят из целлюлозосодержащих материалов (до 40 % бумаги, 2.5% дерева, 8% текстиля) и пищевых отходов (40%). Наиболее экономична и радикальна переработка их метановым брожением, в результате образуется легко транспортируемое топливо - метан.

Сточные воды обычно содержат сложную смесь нерастворимых и растворимых компонентов различной природы и концентрации. Бытовые отходы, как правило, содержат почвенную и кишечную микрофлору, включая патогенные микроорганизмы.

Сточные воды сахарных, крахмальных, пивных и дрожжевых заводов, мясокомбинатов содержат в больших количествах углеводы, белки и жиры, являющиеся источниками питательных веществ и энергии.

Стоки химических и металлургических производств могут содержать значительное количество токсических и даже взрывчатых веществ. Серьезное загрязнение возникает при попадании в окружающую среду соединений тяжелых металлов, таких как железо, медь, олово и др.

Цель очистки сточных вод - удаление растворимых и нерастворимых компонентов, элиминирование патогенных микроорганизмов и проведение детоксикации таким образом, чтобы компоненты стоков не вредили человеку, не загрязняли водоемы. Бактерии рода Pseudomonas практически всеядны. Например, P. putida могут утилизировать нафталин, толуол, алканы, камфару и др. соединения. Выделены чистые культуры микроорганизмов, способные разлагать специфические фенольные соединения, компоненты нефти в загрязненных водах и т.д. Микроорганизмы рода Pseudomonas могут утилизировать и необычные химические соединения - инсектициды, гербициды и другие ксенобиотики. Генетически сконструированные штаммы микроорганизмов в будущем смогут решить проблему очистки сточных вод и почв, загрязненных пестицидами и другими антропогенными веществами.

Азотсодержащие соединения (белки, аминокислоты, мочевина) могут быть удалены в биологическом процессе денитрификации-нитрификации. Биологическое удаление азота и фосфора, являющихся  причинами эвтрофикации (зарастания озер микроводорослями, которые бурно размножаются, затем отмирают, давая пищу аэробным бактериям, потребляющими кислород, что приводит к замору рыбы) озер и каналов, находится в стадии экспериментов.

Тяжелые металлы затрудняют биологические процессы очистки стоков и отрицательно влияют на флору и фауну. Природные штаммы микроорганизмов не могут быть использованы для накопления этих металлов в силу их высоко токсичности. Однако, есть белок высших организмов - металлотионеин, который активно связывает различные тяжелые металлы. Ген, кодирующий синтез мышиного металлотионеина, клонирован в бактериях. Это открывает возможность получения белка в больших количествах с использование иммобилизованных бактерий и его использования для связывания и экстракции тяжелых металлов.

Сельскохозяйственная биотехнология

Биологическая азотфиксация - процесс фиксации атмосферного азота бактериями, живущими в симбиозе с представителями семейства бобовых. Для ускорения заселения ризосферы обычно используют бактериальные удобрения, содержащие культуры азотфиксирующих микроорганизмов, например, клубеньковых бактерий. Методами генной инженерии выведены мутанты клубеньковых бактерий с повышенной способностью к азотфиксации. Ведутся работы по созданию азотфиксирующих растений, способных к симбиозу со злаковыми.

Микробные инсектициды. В последнее время все чаще появляются данные о мутагенном и канцерогенном действии химических пестицидов, которые плохо разрушаются и накапливаются в окружающей среде.

Для получения микробных инсектицидов используются вирусы, грибы, простейшие, наиболее удобны - спорообразующие бактерии. Микробные инсектициды высоко специфичны и действуют только на определенные вредные насекомые, оставляя невредимыми полезные. Патогенность микроорганизмов вызвана действием определенных токсинов, поэтому выработки устойчивости к биопрепаратам у насекомых не происходит.

Микробные пестициды подвержены биодеградации. Микроорганизмы могут регулировать рост растений и животных, подавлять заболевания. Некоторые бактерии изменяют кислотность и соленость почвы, другие продуцируют соединения, связывающие железо, третьи - вырабатывают регуляторы роста. Как правило, микроорганизмами инокулируют семена и или растения перед посадкой.

В животноводстве биотехнология также находит применение. Это диагностика, профилактика, лечение заболеваний с использованием техники моноклональных антител, генетическое улучшение пород животных. Некоторые вещества, полученные с помощью микроорганизмов могут использоваться в виде кормовых добавок, другие - подавляют вредную микрофлору в желудочно-кишечном тракте или стимулируют образование специфических микробных метаболитов.

Подробнее вопросы бактериальных удобрений и энтомопатогенных препаратов для сельского хозяйства рассматриваются в главе: "Биотехнология препаратов для сельского хозяйства", а генно-инженерных модификаций сельскохозяйственных растений и животных в разделе "трансгенные животные".

Биотехнология обработки стоков и контроль загрязнения воды тяжелыми металлами

Некоторые микроорганизмы могут катализировать определенные окислительно-восстановительные реакции - окисление Fe и Mn в воде, окисление серосодержащих соединений, окисление-восстановление азотсодержащих соединений. Аэробные бактерии могут выделять железо, медь, сульфаты.

Биогеотехнология - использование геохимической деятельности микроорганизмов в горнодобывающей промышленности. Это экстракция и концентрирование металлов при биологической очистке сточных вод предприятий горнодобывающей промышленности и флотационных процессах: выщелачивание бедных и отработанных руд, десульфирование каменного угля, окисление пиритов и пиритсодержащих пород.

Своими корнями биогеотехнология уходит в геологическую микробиологию. Микроорганизмы принимали и принимают активное участие в геологических процессах. Биологические свойства различных групп микроорганизмов и особенности их жизнедеятельности в месторождениях полезных ископаемых составляют научные основы биогеотехнологии.

Биогеотехнология стихийно зародилась еще в XVI в. До нас дошли сведения о том, что в те далекие времена в Венгрии для получения меди груды добытой руды орошали водой. Этот нехитрый технологический прием оказался прообразом современного бактериально-химического метода кучного выщелачивания металлов из руд. Конечно, тогда еще не знали, что используемый процесс получения меди по своей природе является микробиологическим. Это стало известно только в 1922 г. благодаря работам немецких ученых Рудольфа и Хельброннера. По-видимому, 1922 г. следует считать официальной датой рождения биогеотехнологии. В дальнейшем биогеотехнология развивалась неровно и своего совершеннолетия достигла к началу 80-х годов нашего века. К этому времени наряду с бактериальным выщелачиванием металлов сформировались и другие разделы биогеотехнологии — удаление серы из углей, борьба с метаном в угольных шахтах, повышение нефтеотдачи пластов.

Биогеотехнология выщелачивания металлов — использование главным образом тионовых (окисляющих серу и серосодержащие соединения) бактерий для извлечения металлов из руд, рудных концентратов и горных пород. При переработке бедных и сложных руд тысячи и даже миллионы тонн ценных металлов теряются в виде отходов, шлаков, «хвостов». Происходят также выбросы вредных газов в атмосферу. Бактериально-химическое выщелачивание металлов уменьшает эти потери . Основу этого процесса составляет окисление содержащихся в рудах сульфидных минералов тионовыми бактериями. Окисляются сульфиды меди, железа, цинка, олова, кадмия и т. д. При этом металлы из нерастворимой сульфидной формы переходят в сульфаты, хорошо растворимые в воде. Из сульфатных растворов металлы извлекаются путем осаждения, экстракции, сорбции. Одним из возможных путей извлечения металлов из растворов является адсорбция металлов клетками живых микроорганизмов, так называемая биосорбция металлов. Металлы включаются в состав специфических белков – металлотионеинов. Полезными для биогеотехнологии добычи металлов свойствами обладает целый ряд микроорганизмов. Но основным из них, безусловно, является открытый в 1947 г. Колмером и Кинкелем вид тионовых бактерий, названный Thiobacillus ferrooxidans. Необходимую для роста энергию эти бактерии получают при окислении восстановленных соединений серы и двухвалентного железа в присутствии свободного кислорода. Они окисляют практически все известные в настоящее время сульфиды металлов. Источником углерода для роста бактерий служит при этом углекислый газ. Характерной особенностью их физиологии является потребность в очень кислой среде. Они развиваются при рН от 1 до 4,8 с оптимумом при 2—3. Интервал температур, в котором могут развиваться бактерии этого вида, составляет от 3 до 40°С с оптимумом при 28°С. Тионовые бактерии широко распространены в природе. Они обитают в водоемах, почвах, угольных и золоторудных месторождениях. В значительных количествах встречаются они в месторождениях серных и сульфидных руд. Но в условиях естественного залегания таких руд активность тионовых бактерий сдерживается отсутствием кислорода. При разработке сульфидных месторождений руды вступают в контакт с воздухом, и в них развиваются микробиологические процессы, приводящие к выщелачиванию металлов. Применяя определенные биотехнологические мероприятия, этот естественный процесс можно ускорить.

Основной технологической операцией этого способа является орошение отвалов добытой руды растворами, содержащими серную кислоту, ионы двух- и трехвалентного железа, а также жизнеспособные клетки тионовых бактерий. Иногда для усиления процессов выщелачивания внутрь отвала подают воздух. В таких условиях выщелачивающий раствор фильтруется через толщу руды и в результате микробиологических и химических процессов обогащается извлекаемыми из руды металлами. Затем этот раствор собирают с помощью системы коллекторов, и из него извлекают металлы одним из физико-химических методов. Ежегодно в мире таким способом добывают сотни тысяч тонн меди, или примерно 5 % от ее общей добычи. В ряде стран этим способом получают также значительные количества урана.

Биогеотехнология обессеривания углей — использование тионовых бактерий для удаления серосодержащих соединений из углей. Как бурые, так и каменные угли нередко содержат значительные количества серы. Общее содержание серы в углях может достигать 10—12 %. При сжигании углей содержащаяся в них сера превращается в сернистый газ, который поступает в атмосферу, где из него образуется серная кислота. Из атмосферы серная кислота выпадает на поверхность земли в виде сернокислотных дождей.

По имеющимся данным, в некоторых странах Западной Европы в год на 1 га земли с дождями выпадает до 300 кг серной кислоты. Нетрудно себе представить, какой ущерб наносят кислотные дожди здоровью человека, его хозяйственной деятельности и окружающей природе. Кроме этого, высокосернистые угли плохо коксуются и поэтому не могут быть использованы в цветной металлургии. Микробное удаление серы из углей, по мнению специалистов, является экономически выгодным, и с ним связывают надежды на решение проблемы сернокислотных дождей.

Первые опыты по направленному удалению серы из угля с использованием микроорганизмов были выполнены в 1959 г. в нашей стране 3. М. Зарубиной, Н. Н. Ляликовой и Е. И. Шмук. В результате этих опытов за 30 суток с участием бактерий Th. ferrooxidans из угля было удалено 23—30 % серы. Позднее несколько работ по микробиологическому обессериванию угля было опубликовано американскими исследователями. Им удалось с помощью тионовых бактерий снизить содержание пиритной серы в каменном угле за четверо суток почти на 50 %.

Этот метод будет сопровождаться попутным выщелачиванием различных металлов. Известно, что в заметных количествах содержится в углях германий, никель, бериллий, ванадий, золото, медь, кадмий, свинец, цинк, марганец. Попутное получение ценных металлов при десульфуризации угля должно дать дополнительный экономический эффект.

Работы по удалению пиритной серы из угля микробиологическим путем проводятся сейчас во многих странах мира. По последним сообщениям в лабораторных условиях удается снизить содержание серы в угле путем микробиологического выщелачивания за 5 суток почти на 100 %. Микробиологический способ десульфуризации углей рассматривается как весьма перспективный.

Биогеотехнология и борьба с метаном в угольных шахтах — использование метанокисляющих бактерий для снижения концентрации метана в угольных пластах и выработанных пространствах.

В пластах каменного угля содержится огромное количество метана, достигающее сотни кубометров в 1 т угля. При этом чем глубже залегает уголь в недрах земли, тем больше метана он содержит. При подземной добыче угля метан из разрабатываемых угольных пластов и образующихся при этом выработанных пространств поступает в атмосферу шахт. Скопления этого взрывоопасного газа в горных выработках создают постоянную угрозу для жизни шахтеров. Известны случаи крупных взрывов метана в угольных шахтах мира, унесшие сотни человеческих жизней.

Традиционные средства борьбы с метаном в угольных шахтах (вентиляция, вакуумная дегазация, увлажнение пластов водой) в условиях постоянной интенсификации горных работ и перехода на все более глубокие угленосные горизонты часто уже не могут обеспечить одновременно высокий уровень угледобычи и безопасные условия труда. В основе биогеотехнологических способов борьбы с метаном лежит процесс поглощения этого газа метанокисляющими бактериями в угольных пластах и выработанных пространствах. На данном уровне развития наук этот процесс представляет собой единственную возможность разрушения молекулы метана при температурах разрабатываемых угленосных толщ.

Идея об использовании метанокисляющих бактерий для борьбы с метаном в угольных шахтах принадлежит советским ученым. В 1939 г. А. 3. Юровский, Г. П. Капилаш и Б. В. Мангуби предложили применять эти бактерии для снижения выделения метана из выработанных пространств. Несмотря на широкое распространение метанокисляющих бактерий в природе, в угольных пластах и прилегающих породах они отсутствуют. Поэтому необходимое количество активных метанокисляющих бактерий выращивают в ферментерах и в виде суспензии в питательной среде подают в поровый объем угольных пластов и выработанные пространства. Рабочая суспензия приготовляется непосредственно в шахте. В рудничную воду добавляют заданное количество биомассы метанокисляющих бактерий и недостающие для их активной жизнедеятельности минеральные соли. Обычно это минеральные соединения азота и фосфора. В угольный пласт рабочая суспензия нагнетается насосами через скважины, пробуренные по углю или из подземных выработок, или с поверхности земли: 1 т угля может принять 20—40 л рабочей суспензии. В угле микроорганизмы распределяются по трещинам и порам.

Таким путем осуществляется насыщение угля метаноокисляющими бактериями. Но для развития этих бактерий необходим свободный кислород, которого нет в угольных пластах. Поэтому в насыщенный метанокисляющими бактериями участок угольного пласта через те же скважины компрессором постоянно прокачивается воздух. В таких условиях бактерии потребляют содержащийся в угле метан, и за счет этого происходит уменьшение исходной газоносности угольного пласта. Микробиологические способы борьбы с метаном были неоднократно испытаны в угольных шахтах. Поступление метана как из угольных пластов, так и из выработанных пространств в ходе этих испытаний было снижено в среднем в 2 раза. При прочих равных условиях это позволяет повышать добычу угля примерно в 1,5 раза.

Биогеотехнология и повышение нефтеотдачи пластов — использование различных групп микроорганизмов для увеличения вторичной добычи нефти.

Нефть, как известно, является в настоящее время основным энергетическим и химическим сырьем. Однако по некоторым прогнозам мировые запасы нефти могут быть исчерпаны уже в течение ближайших 50 лет. Вместе с тем существующая технология позволяет извлекать только половину нефти, содержащейся в месторождениях. Это обусловлено прочной связью нефти с вмещающими ее породами. Повышение нефтеотдачи пластов на 10— 15 % было бы равносильно открытию новых месторождений. В связи с этим в настоящее время заметно возрос интерес к поиску путей и средств повышения вторичной добычи нефти.

Один из способов предполагает использование комплекса углеводородокисляющих и метанобразующих бактерий для увеличения нефтеотдачи пластов основано на активации геохимической деятельности этих микробов в нефтяной залежи, куда они попадают вместе с закачиваемыми через скважины поверхностными водами. Активация названных микробиологических процессов достигается путем аэрации закачиваемых вод и добавления в них минеральных солей азота и фосфора. Недостаток этих химических элементов чаще всего лимитирует активность микрофлоры в природных условиях. Нагнетание в нефтяную залежь обогащенной кислородом и минеральными солями воды приводит к образованию аэробной зоны в нефтеносном пласте вокруг нагнетательной скважины. Здесь начинают интенсивно идти процессы разрушения нефти аэробными углеводородокисляющими микробами. Это сопровождается накоплением углекислого газа, водорода и низкомолекулярных органических кислот, которые поступают в анаэробную зону нефтяной залежи. Здесь они превращаются метанобразующими бактериями в метан. Разрушение нефти и образование газов приводят к разжижению нефти и повышению газового давления в нефтеносном пласте, что и должно сопровождаться увеличением добычи нефти из добывающих скважин.

Биотехнология в медицине

Антибиотики—самый большой класс фармацевтических соединений, синтез которых осуществляется микробными клетками. К этому же классу относятся противогрибковые агенты, противоопухолевые лекарства и алкалоиды. В 1980 г. мировое производство антибиотиков составляло примерно 25000 т, из них 17000 т — пенициллины, 5000 т —  тетрациклины, 1200 т — цефалоспорины и 800 т —эритромицины. В 1945 г. Бротзу из Института гигиены в Кальари (Сардиния) выделил из пробы морской воды плесень Cephalosporium acremonium, синтезирующую несколько антибиотиков; один из них, цефалоспорин С, оказался особенно эффективен против устойчивых к пенициллину грамположительных бактерий.

Из нескольких тысяч открытых антибиотиков львиная доля принадлежит актиномицетам. Среди актиномицетов наибольший вклад вносит род Streptomyces, включая тетрациклины (один только вид Streptomyces griseus синтезирует более пятидесяти антибиотиков). Наиболее распространенными с коммерческой точки зрения оказались пенициллины, цефалоспорины и тетрациклины. Начиная с середины 1960-х гг. в связи с возросшей сложностью выделения эффективных антибиотиков и распространением устойчивости к наиболее широко применяемым соединениям у большого числа патогенных бактерий исследователи перешли от поиска новых антибиотиков к модификации структуры уже имеющихся. Они стремились повысить эффективность антибиотиков, найти защиту от инактивации ферментами устойчивых бактерий и улучшить фармакологические свойства препаратов.

Большинство исследований было сосредоточено на пенициллинах и цефалоспоринах, структура которых включает четырехчленное -лактамное кольцо. Добавление к -лактамному кольцу метоксильной (СН₃О)-группы привело к появлению цефамицинов, близких к цефалоспоринам и эффективных как против грамотрицательных, так и против пенициллиноустойчивых микробов. Полусинтез состоит в замене химическим путем одной боковой цепи -лактамного кольца на другую в полученной ферментацией молекуле. Устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам связана с наличием ферментов, так называемых -лактамаз, которые широко распространены среди бактерий, актиномицетов, цианобактерий и дрожжей. Так как гены, кодирующие эти ферменты, находятся в составе плазмид, устойчивость может передаваться при переносе плазмид от одного бактериального штамма к другому. Исследователи фирмы «Мерк, Шарп и Доум» открыли новый класс -лактамных антибиотиков, тиенамицины, продуцируемых Streptomyces cattleya. Тиенамицины чрезвычайно эффективны против грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также способны ингибировать -лактамазы, что значительно повышает возможности этих антибиотиков. К ингибиторам -лактамаз относятся также клавулановая и оливановая кислоты, идентифицированные исследователями английской фармацевтической компании «Бичем». Компания выпустила новый антибиотик, аугментин, который представляет собой комбинацию -лактамного антибиотика амоксициллина и клавулановой кислоты.

Антибиотики вырабатываются в результате совместного действия продуктов 10—30 генов, поэтому практически невозможно обнаружить отдельные спонтанные мутации, которые могли бы повысить выход антибиотика с нескольких миллиграммов на литр в штамме дикого типа до 20 г/л и более пенициллина или тетрациклина в промышленных штаммах Penicillium chrysogenum или Streptomyces auerofaclens. Эти высокопродуктивные штаммы были получены в результате последовательных циклов мутагенеза и селекции. В результате мутаций появились новые вторичные метаболиты, в том числе 6-деметилхлортетрациклин и 6-деметилтетрациклин. Определенные мутанты, так называемые идиотрофы, способны синтезировать только половину молекулы антибиотика, а среда должна быть обогащена другой ее половиной. Такая форма мутационного биосинтеза привела к открытию новых производных антибиотиков, среди них принадлежащие к аминоциклитольной группе.

Число противоопухолевых веществ микробного происхождения довольно ограниченно. Блеомицин, выделенный Умезавой с сотр. в Токийском институте микробной химии из культур Streptomyces verticilliis, представляет собой гликопептид, который действует, разрывая ДНК опухолевых клеток и нарушая репликацию ДНК и РНК. Другая группа противоопухолевых агентов создана на основе комбинации аминогликозпдной единицы и молекулы антрациклина. Недостатком обоих соединений является их потенциальная опасность для сердца.

В медицине применяют также аминокислоты, например, аргинин. В сочетании с аспартатом или глутаматом он помогает при заболевании печени. K-Na-аспартат снимает усталость и облегчает боли в сердце, его рекомендуют при заболевании печени и диабете. Цистеин защищает SH-ферменты в печени и других тканях от окисления и оказывает детоксицирующее действие. Он проявляет также защитное действие от повреждения, вызываемых облучением. Дигидроксифенилаланин и D-фенилаланин эффективны при болезни Паркинсона. Из полиаминокислот получают хороший материал для хирургии.

В медицине также используют зеленую водоросль Scenedesmus. Ее культивируют в жидкой питательной среде (установки дают до 80 тонн водорослей в год), извлекают и проводят экстракцию этиловым спиртом. Биомассу отделяют и подвергают ферментативному гидролизу щелочной протеазой. Около 50% белков при этом распадается до пептидов. Гидролизат содержит почти все незаменимые аминокислоты, представляет собой порошок желтовато-зеленого цвета с приятным запахом и вкусом. Используется этот продукт для быстрого восстановления организма, а также как компонент косметических средств. Если вместо обработки этанолом провести двукратную экстракцию дистиллированной водой, а затем высушить, то получается порошок светло-желтого цвета. Его используют как биостимулятор и готовят из него препараты для лечения плохо заживающих ран.

Еще в начале 90-х годов появились статьи, в которых рассматривались перспективы использования сапротрофной микрофлоры как продуцента биологически активных веществ (БАВ). Предполагается вводить в организм сапрофитные микроорганизмы, которые могли бы жить в условиях симбиоза с нормальной микрофлорой организма. Вещества, вырабатываемые бактериальными штаммами включаются в систему биохимических процессов организма. В случае нарушения нормального биохимического статуса организма они корректируют его, а при патологическом процессе – задерживают его или способствуют прекращению. Такое введение получило название «микробиологическая подсадка». К 1992 году было описано уже более 50 таких штаммов и проанализирован диапазон биологических эффектов секретируемых БАВ. Для лечения широкого спектра заболеваний (бактериальные инфекции кишечника, дыхательных путей, гнойных инфекций, аллергий) успешно применяются штаммы Bacillus subtilis (препарат «Бактисубтил», например, используют при лечении диареи). Штаммами E. coli лечат ряд кишечных заболеваний. БАВ, секретируемые сапротрофами, могут регулировать ферментативные процессы в организме и вступать во взаимодействие с поступающими в организм ксенобиотиками. Штаммы можно получать непосредственно от человека, тогда они будут представлять его естественную микрофлору. Можно целенаправленно выводить лабораторные мутантные штаммы, в том числе методами генной инженерии и вводить их в организм. Способы введения могут быть различны: капсулы, растворимые в кишечном соке, культуры штаммов-продуцентов на пленочной основе, в виде свечей, а при легочных заболеваниях – в виде аэрозолей.

Новым направлением в медицине является использование ферментных препаратов типа «контейнер», изготовление которых стало возможным появлению и совершенствованию методов иммобилизации веществ. Эти препараты представляют собой микросферы с более или менее твердой и проницаемой оболочкой. Назначение этих лекарственных препаратов различное. Первым типом «искусственных клеток» следует назвать микрокапсулы. Фермент, находящийся внутри оболочки, не контактирует с жидкостями и тканями организма, не разрушается протеиназами, не ингибируется, не вызывает иммунного ответа организма. Основное достоинство микрокапсул заключается в том, что их можно имплантировать в нужное место, например в непосредственной близости от опухоли. При этом микрокапсула с соответствующим содержанием будет перерабатывать метаболиты, необходимые для роста опухолевой ткани, и эта ткань не будет развиваться. Капсулы могут содержать микроскопические участки тканей. Например, имеются экспериментальные данные по созданию депо инсулина путем имплантации микрокапсул, содержащих островки Лангерганса, синтезирующие в поджелудочной железе инсулин. Известно, что терапии диабетических заболеваний уделяется много внимания. Имплантация лекарственного начала избавила бы пациентов от ежедневных инъекций инсулина.

Следует учитывать, что микрокапсулы, вводимые в кровь, могут забивать кровеносные сосуды и, следовательно, являться причиной образования тромбов. Однако эффективность микрокапсул при использовании их в виде колонок для диализа в аппарате «искусственная почка» несомненна. При этом объем аппаратов и, соответственно, количество необходимых и очень дорогих растворов резко сокращается. Например, для микрокапсулированной «искусственной почки» требуется колонка объемом всего 30 мл, которая работает почти в 100 раз быстрее обычного аппарата. Развитие такой техники сдерживается пока высокой стоимостью, а также необходимостью использовать уже существующую тоже очень дорогую технику. Вероятно, ферментные реакторы на микрокапсулах будут применяться для деградации недиализуемых материалов. Внутрь микрокапсул могут быть включены магнитные частицы. В этом случае извне подводят магнитное поле и препарат удерживают вблизи органа-мишени.

В ряде случаев используются высокомолекулярные соединения, растворимые в определенных условиях и сохраняющие высокую прочность оболочек в других. Так ведет себя ацетилфталилцеллюлоза, микрокапсулы из которой интактны в желудочном соке и растворяются в кишечнике, освобождая содержимое. Сейчас интенсивно исследуются свойства микрокапсул, стенка которых состоит из оболочек эритроцитов. Содержимое эритроцитов удаляется, а «тень» заполняется ферментом. Серьезные успехи достигнуты при лечении аспарагин-зависимых опухолей препаратами аспарагиназы в оболочках эритроцитов. Используются оболочки и других клеток. Так, описаны лекарственные препараты, включенные в оболочки макрофагов. Последние имеют тенденцию накапливаться в очагах воспалений, а следовательно, могут транспортировать туда как низко-, так и высокомолекулярный лекарственный препарат. Существенной положительной стороной «теней» клеток в качестве носителя является их полная совместимость с организмом пациента, поскольку этот носитель готовят на основе клеток, выделенных из крови пациента, и возвращают их ему же с новым содержимым.

Задача введения лекарственного препарата в клетки может быть решена путем создания контейнеров-переносчиков типа липосом или мицелл. Оболочка липосомы представляет собой однослойную или многослойную поверхность, образованную, в свою очередь, бислойной структурой, созданной соединениями, имеющими два гидрофобных, достаточно протяженных участка и гидрофильную группу. Гидрофобные концы слипаются между собой и образуют пленку, обе стороны которой гидрофильны. Липосома, специфически или неспецифически адсорбировавшись на клетке, может быть поглощена ею путем фагоцитоза, и фермент внутри высвобождается.

Хорошо известно, что протеиназы, расщепляя денатурированные белки, способствуют очищению ран, и следовательно, их заживлению. В этом направлении в клинической практике с помощью иммобилизованных протеиназ сделано многое. В качестве носителей для иммобилизации протеолитических ферментов наиболее употребимы волокнистые материалы на основе целлюлозы, поливинилового спирта, солей альгиновой кислоты, полиамидное и коллагеновое волокно. Готовят нити, в которые при формовании включают фермент и используют их в качестве шовного материала. Сравнительный анализ действия нативных и иммобилизованных протеиназ (в основном химотрипсина, трипсина, коллагеназы) показал, что уже на 2—4-й день рана очищается от некротических масс и по крайней мере вдвое быстрее наступает грануляция. Убедительные результаты получены при лечении трофических язв, лучевых язв кожи. Особенно эффективны иммобилизованные протеиназы при предоперационной подготовке и после пластических операций. Иммобилизованные протеолитические ферменты с большим успехом применяются в лечении гнойных заболеваний легких и плевры.

Биотехнологии в пищевой промышленности

Статистические данные ООН по вопросам продовольствия и сельского хозяйства свидетельствуют о том, что проблема обеспечения населения нашей планеты продуктами питания внушает серьезные опасения. По этим данным, более половины населения Земли не обеспечено достаточным количеством продуктов питания, примерно 500 млн. людей голодают, а около 2 млрд. питаются недостаточно или неправильно. К концу XX в. население нашей планеты с учетом контроля рождаемости составило 7,5 млрд. человек. Следовательно, тяжелое уже сейчас положение с продуктами питания может принять в недалеком будущем для некоторых народов угрожающие масштабы.

Пища должна быть разнообразной и содержать белки, жиры, углеводы и витамины. Источники энергии — жиры и углеводы в определенных пределах взаимозаменяемы, причем их можно заменить и белками, но белки нельзя заменить ничем. Проблема питания людей в конечном счете заключается в дефиците белка. Там, где сегодня люди голодают, не хватает прежде всего белка. Установлено, что ежегодный дефицит белка в мире, по самым скромным подсчетам, оценивается в 15 млн. т. Наибольшую популярность как источники белка приобрели семена масличных культур — сои, семян подсолнечника, арахиса и других, которые содержат до 30 процентов высококачественного белка. По содержанию некоторых незаменимых аминокислот он приближается к белку рыбы и куриных яиц и перекрывает белок пшеницы. Белок из сои широко уже используется в США, Англии и других странах как ценный пищевой материал.

Эффективным источником белка могут служить водоросли. Увеличить количество пищевого белка можно и за счет микробиологического синтеза, который в последние годы привлекает к себе особое внимание. Микроорганизмы чрезвычайно богаты белком — он составляет 70—80 процентов их веса. Скорость его синтеза огромна. Микроорганизмы примерно в 10—100 тысяч раз быстрее синтезируют белок, чем животные. Здесь уместно привести классический пример: 400-килограммовая корова производит в день 400 граммов белка, а 400 килограммов бактерий — 40 тысяч тонн. Естественно, на получение 1 кг белка микробиологическим синтезом при соответствующей промышленной технологии потребуется средств меньше, чем на получение 1 кг белка животного. Да к тому же технологический процесс куда менее трудоемок, чем сельскохозяйственное производство, не говоря уже об исключении сезонных влияний погоды — заморозков, дождей, суховеев, засух, освещенности, солнечной радиации и т. д.

Применяя обычные технологические линии по производству синтетических волокон, можно получать из искусственных белков длинные нити, которые после пропитки их формообразующимн веществами, придания им соответствующего вкуса, цвета и запаха могут имитировать любой белковый продукт. Таким способом уже получены искусственное мясо (говядина, свинина, различные виды птиц), молоко, сыры и другие продукты. Они уже прошли широкую биологическую апробацию на животных и людях и вышли из лабораторий на прилавки магазинов США, Англии, Индии, стран Азии и Африки. Только в одной Англии их производство достигает примерно 1500 тонн в год. Интересно, что белковую часть школьных обедов в США уже разрешено на 30 процентов заменять искусственным мясом, созданным на основе соевого белка.

Используемое в питании больных Ричмондского госпиталя (США) искусственное мясо получило высокую оценку главного диетолога. Правда, когда больным давали антрекот из искусственного мяса, они жаловались на его тестоватость, хотя и не знали и даже не догадывались о том, что получали не естественный продукт. А когда мясо подавалось в виде мелко нарезанных кусочков, нареканий не было. Обслуживающий персонал также употреблял искусственное мясо, не догадываясь о подделке. Они воспринимали его как натуральную говядину. Врачи госпиталя отмечали также положительное влияние рациона на здоровье пациентов и особенно больных атеросклерозом. В состав такого мяса обязательно включают специально обработанный искусственный белок, небольшое количество яичного альбумина, жиры, витамины, минеральные соли, природные красители, ароматизаторы и прочее, что дает возможность «лепить» изделие с заданными свойствами, учитывая при этом физиологические особенности организма, для которого продукт предназначен. Это особенно важно в диете детей и людей пожилого возраста, больных и выздоравливающих, когда необходимо лимитировать питание по целому ряду пищевых компонентов, что весьма трудно сделать, используя традиционные продукты. Такое мясо можно резать, замораживать, консервировать, сушить или прямо использовать для приготовления различных блюд. 

Из 20 аминокислот, входящих в состав белков, 8 аминокислот люди не могут синтезировать, и их относят к незаменимым. Это изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, валин, фенилаланин. Аминокислоты — это не только питательные вещества, но также ароматические и вкусовые агенты, и потому они широко используются в пищевой промышленности.

Как питательную добавку в пищу чаще всего вносят лизин и метионин. Глутамат натрия и глицин употребляют как ароматические вещества для усиления и улучшения вкуса пищи. У глицина освежающий, сладкий вкус. Его вводят в сладкие напитки, и кроме того, он проявляет там бактериостатическое действие. Цистеин предотвращает подгорание пищи, улучшает пекарские процессы и качество хлеба. Благодаря некоторым бактериям удается получать около 100 г/л глутаминовой аминокислоты. Ежегодно в мире производят микробиологическим способом 270 000 т этой аминокислоты, основная часть которой идет в пищевую промышленность. По объему продукции второе место после глутаминовой кислоты занимает лизин — 180 000 т в год. Другие аминокислоты производят в гораздо меньших количествах.

Аминокислоты в большом количестве применяют как добавку к растительным кормам, которые дефицитны по метионину, треонину, триптофану и особенно по лизину. Если в животных белках содержится 7—9 % лизина, то в белках пшеницы — только около 3 %. Внесение в корма лизина до содержания 0,3 % позволяет сократить их расход больше чем на 20 %. За последние 8 лет количество аминокислот, добавляемых в корма, выросло в 14 раз. Во многих странах метионин добавляют к соевой муке — белковой добавке кормов. Главная область практического применения аминокислот — обогащение кормов. Около 66 % общего количества аминокислот, получаемых в промышленности, используют в кормах, 31 % — в пище и 4 % — в медицине, косметике и как химические реактивы. На основе аминокислот готовят искусственный подсластитель — метиловый эфир L-аспартил-L-фенилаланина, который в 150 раз слаще, чем глюкоза.

Биотехнология молочных продуктов

Спектр продуктов питания, получаемых при помощи микроорганизмов, обширен. Это продукты, получаемые в результате брожения - хлеб, сыр, вино, пиво, творог и так далее. До недавнего времени биотехнология использовалась в пищевой промышленности с целью усовершенствования освоенных процессов и более умелого использования микроорганизмов, но будущее здесь принадлежит генетическим исследованиям по созданию более продуктивных штаммов для конкретных нужд, внедрению новых методов в технологии брожения.

Получение молочных продуктов в пищевой промышленности построено на процессах ферментации. Основой биотехнологии молочных продуктов является молоко. Молоко (секрет молочных желез) - уникальная естественная питательная среда. Она содержит 82-88% воды и 12-18% сухого остатка. В состав сухого молочного остатка входят белки (3,0-3,2%), жиры (3,3-6,0%), углеводы (молочный сахар лактоза - 4,7%), соли (0,9-1%), минорные компоненты (0,01%): ферменты, иммуноглобулины, лизоцим и т.д. Молочные жиры очень разнообразны по своему составу. Основные белки молока - альбумин, казеин. Благодаря такому составу молоко представляет собой прекрасный субстрат для развития микроорганизмов. В сквашивании молока обычно принимают участие стрептококки и молочнокислые бактерии. Путем использования реакций, которые сопутствуют главному процессу сбраживания лактозы получают и другие продукты переработки молока: сметану, йогурт, сыр и т.д. Свойства конечного продукта зависят от характера и интенсивности реакций ферментации. Те реакции, которые сопутствуют образованию молочной кислоты, определяют обычно особые свойства продуктов. Например, вторичные реакции ферментации, идущие при созревании сыров, определяют вкус отдельных их сортов. В таких реакциях принимают участие пептиды, аминокислоты и жирные кислоты, находящиеся в молоке.

Все технологические процессы производства продуктов из молока делятся на две части: 1) первичная переработка - уничтожение побочной микрофлоры; 2) вторичная переработка. Первичная переработка молока включает в себя несколько этапов. Сначала молоко очищается от механических примесей и охлаждается, чтобы замедлить развитие естественной микрофлоры. Затем молоко сепарируется (при производстве сливок) или гомогенизируется. После этого проводят пастеризацию молока, при этом температура поднимается до 80^оС, и оно закачивается в танки или ферментеры. Вторичная переработка молока может идти двумя путями: с использованием микроорганизмов и с использованием ферментов. С использованием микроорганизмов выпускают кефир, сметану, творог, простокваши, казеин, сыры, биофруктолакт, биолакт, с использованием ферментов - пищевой гидролизат казеина, сухую молочную смесь для коктейлей и т.д. При внесении микроорганизмов в молоко лактоза гидролизуется до глюкозы и галактозы, глюкоза превращается в молочную кислоту, кислотность молока повышается, и при рН 4-6 казеин коагулирует.

Молочнокислое брожение бывает гомоферментативным и гетероферментативным. При гомоферментативном брожении основным продуктом является молочная кислота. При гетероферментативном брожении образуются диацетил (придающий вкус сливочному маслу), спирты, эфиры, летучие жирные кислоты. Одновременно идут протеолитические и липолитические процессы, что делает белки молока более доступными и обогащает дополнительными вкусовыми веществами.

Для процессов ферментации молока используются чистые культуры микроорганизмов, называемые заквасками. Исключение составляют закваски для кефиров, которые представляют естественный симбиоз нескольких видов молочнокислых грибков и молочнокислых бактерий. Этот симбиоз в лабораторных условиях воспроизвести не удалось, поэтому поддерживается культура, выделенная из природных источников. При подборе культур для заквасок придерживаются следующих требований:

- состав заквасок зависит от конечного продукта (например, для получения ацидофилина используется ацидофильная палочка, для производства простокваши - молочнокислые стрептококки);

- штаммы должны отвечать определенным вкусовым требованиям; - продукты должны иметь соответствующую консистенцию, от ломкой крупитчатой до вязкой, сметанообразной;

- определенная активность кислотообразования;

- фагорезистентность штаммов (устойчивость к бактериофагам);

- способность к синерезису (свойству сгустка отдавать влагу);

- образование ароматических веществ; - сочетаемость штаммов (без антагонизма между культурами);

- наличие антибиотических свойств, т.е. бактериостатическое действие по отношению к патогенным микроорганизмам;

- устойчивость к высушиванию.

Культуры для заквасок выделяются из природных источников, после чего проводится направленный мутагенез и отбор штаммов, отвечающих перечисленным выше требованиям. Биотехнологии на основе молока включают, как правило, все основные стадии биотехнологического производства, которые можно рассмотреть на примере сыроварения.

Сыроварение - один из древнейших процессов, основанных на ферментации. Сыры бывают самые разнообразные - от мягких до твердых. Мягкие сыры содержат много воды, 50-60%, а твердые - мало, 13-34%. На первом этапе идет подготовка молока (первичная обработка). На втором - готовится культура молочнокислых бактерий. Микроорганизмы подбираются в определенной пропорции, обеспечивающей наилучшее качество. Набор бактерий также зависит от температуры термообработки. Третья стадия - стадия ферментации, - в сыроварении в некоторых случаях происходит в 2 этапа, до и после стадии выделения. Сначала молоко инокулируют определенными штаммами микроорганизмов, приводящими к образованию молочной кислоты, а также добавляют сычужный фермент реннин. Реннин ускоряет превращение жидкого молока в сгусток (створаживание) в несколько раз. Эта реакция активируется молочной кислотой, вырабатываемой бактериями. Функции реннина могут выполнять и другие протеиназы, но реннин также участвует в процессах протеолиза, происходящих в сыре при созревании. После образования сгустка сыворотку отделяют, а полученную творожистую массу подвергают термообработке и прессуют в формах. Далее сгусток солят и ставят на созревание. Иногда полученная масса происходит дополнительную обработку, которая заключается в следующем: заражение спорами голубых плесневых грибов при производстве рокфора; нанесение на поверхность спор белых плесневых грибов при производстве камамбера и бри; нанесение бактерий, необходимых для созревания некоторых сыров. Некоторые сыры после выделения должны подвергнуться дальнейшей ферментации (стадия созревания). Микроорганизмы и ферменты в ходе этого процесса гидролизуют жиры, белки и некоторые другие вещества молодого сыра. В результате их распада образуются вещества, придающие сырам характерный вкус.

Процессы ферментации при производстве многих молочных продуктов, таких как сметана, творог, многие сыры идут в ферментерах открытого типа. Как правило, они занимают немного времени. К одним из самых простых относят производство кефира, простокваш, сметаны и масла. Например, при производстве сметаны к сливкам добавляют 0,5-1% закваски, используемой при производстве масла. Далее продукт выдерживают, пока концентрация кислоты не достигнет 0,6%. В заключение хотелось бы добавить, что процессы получения молочнокислых продуктов весьма просты и доступны для воспроизводства в домашних условиях. Они не требуют строгих условий соблюдения стерильности, протекают, как правило, при комнатной или чуть повышенной температуре. Собственно, изначально они были одними из первых "домашних" биотехнологий, которые были позднее поставлены на промышленную основу.