Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

Хід роботи:

Проведення екскурсії та знайомство з типами ферментаційних процесів:

-Періодичним аеробним рідкофазним;

-Проточним в лабораторному ферментері на гетеротрофному субстраті;

-Проточному в лабораторному ферментері на газовому субстраті;

-Відвідування дослідного виробництва мікробіологічних препаратів.

Робота № 12. Періодичне культивування мікроорганізмів та культивування з підживленням субстратів

Найпростіше лабораторне обладнання для вирощування мікроорганізмів у періодичному режимі включає термостатуєму качалку або магнітні мішалки, на які встановлюються колби (рис.22).

Мета роботи: вивчення техніки культивування мікроорганізмів в режимі періодичного процесу.

Матеріали та обладнання:

1.Музейна культура штаму R. eutrophus B-5786;

2.Стерильний розчин базового фосфатного буфера для середовища;

3.Маточні стерильні розчини мікроелементів, заліза лимонно-кислого, сульфату магнію і хлористого амонію;

4.Шпателі, спиртівка, мірний посуд, піпетки, колби для вирощування бактерій, гумові пробки з мікробіологічними фільтрами;

5.Термостатуєма качалка, газгольдер, вакуумний насос, газові субстрати (водень, кисень, вуглекислота).

Рис. 22. Апаратурна схема культивування мікроорганізмів при періодичному режимі:

1- холодильна камера для зберігання штамів-продуцентів; 2 – колекція штамів; 3- ламінар-бокс; 4 – УФ-опромінення; 5 – колби для отримання накопичувальних культур; 6 – фільтр; 7 – качалка; 8 – колби для отримання посівного матеріалу; 9 – платформа для колб; 10 – електродвигун; 11 – блок термостабілізації; 12 – колби на магнітних мішалках; 13 – регулятор току.

62

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

Робота № 13. Проточні культури: хемостат, турбідостат

Метод проточного культивування увійшов до промислової біотехнології і базується на процесах хімічної технології. Принцип проточного культивування полягає в тому, що до біореактора, де розмножуються мікроорганізми, безперервно подається свіже живильне середовище і одночасно відбирається такий же обсяг культури. За таким принципом організовуються два різних процеси культивування: процес повного витіснення і процес повного змішування. У першому випадку біореактор для вирощування являє собою тубус, тубулярний ферментер, у який подається живильне середовище і посівний матеріал і відбирається культура (рис.23). Перемішування не відбувається.

Рис.23. Схема тубулярного біореактору повного витиснення:

концентрація субстрату: S0 –у середовищі, що подається до ферментеру; S1 –у середовищі, що відбирається; S – у ферментері; щільність популяції: Х0 – популяції, що є посівним матеріалом, Х – у ферментері, Х1 – у культурі, що відбирається; Р – продукт.

Подібним чином можна культивувати мікроорганізми, що не потребують аерації. З одного кінця ферментера, куди подається середовище і культура, клітини знаходяться на початку стадії росту; в міру проходження клітинами фаз росту культура "старіє", вичерпується субстрат, накопичуються продукти метаболізму і перед витіканням культура перебуває в стані, аналогічному стаціонарній фазі росту періодичної культури. Таким чином, у ферментері відтворюється повна крива росту, але не в часі, а в просторі.

Безперервні процеси. У безперервних процесах біооб'єкт постійно підтримується в експоненційній фазі росту. Забезпечується безперервний приплив свіжого живильного середовища в біореактор і відтік з нього натуральної рідини, що містить клітини та продукти їх життєдіяльності.

Фундаментальним принципом безперервних процесів служить рівновага між приростом біомаси за рахунок поділу клітин та їх спадом в результаті розбавлення свіжим середовищем:

μ = D,

де μ – питома швидкість росту клітин, D – коефіцієнт розбавлення (швидкість убутку концентрації клітин). Розрізняють хемостатний та турбідостатний режими безперервного культивування.

У процесі повного змішування ріст відбувається в ємності - ферментері при інтенсивному перемішуванні (рис.24).

64

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

Перемішування досягається продуванням повітря або роботою мішалки або тим і іншим способом одночасно. У всій масі культури умови повинні бути абсолютно однаковими. Цей метод культивування називається гомогенно-безперервним або гомогенно-проточним. У ферментері створюються умови, відповідні одній точці кривої росту. При швидкому протоці середовища ці умови близькі до швидкого експоненціального росту, при повільному - наближаються до умов

Рис.24. Схеми біореакторів для проточного культивування мікроорганізмів:

А - Хемостат; Б - турбідостат з автоматичною регуляцією оптичної щільності; 1 - надходження середовища, 2 - мішалка, 3 - збирання культури, 4 - насос, 5 -

фотоелемент, 6 - джерело світла

стаціонарної фази. При такому методі культивування може бути відтворена будь-яка періодична культура від початку уповільнення росту після експоненційної фази і до кінця стадії уповільнення. У сталому режимі швидкість протоку середовища дорівнює питомій швидкості росту культури. При цьому культура знаходиться в стійкому стані динамічної рівноваги і володіє здатністю адаптуватися до змін умов.

При хемостатному режимі культивування в біореактор з постійною контрольованою швидкістю подають живильне середу, один з компонентів якого надходить у кількості, що не є достатньою для забезпечення максимальної швидкості росту культури. У цьому випадку реактор з біооб'єктом набуває властивості саморегульованої системи, автоматично задовольняє рівності μ = D. Якщо спочатку швидкість розбавляння і вимивання біомаси перевищує швидкість росту клітин, то наступає розбавлення культури свіжим середовищем. Це веде до підвищення концентрації компонента, що обмежує ріст, внаслідок чого швидкість росту культури збільшується. Як тільки μ перевищить D, в реакторі починає концентруватися біомаса. Подальше збільшення популяція клітин все активніше призводить до зменшення концентрації живильних елементів у субстраті, його концентрація падає, що, у свою чергу, веде до гальмування росту культури. Таким чином, після серії згасаючих коливань швидкість росту культури стає рівною швидкості росту її розведення.

65

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

Біореактор, що працює в хемостатному режимі культивування, називається хемостат. Він включає: 1) пристрій для подачі живильного середовища; 2) пристосування для відтоку культуральної рідини з клітинами; 3) систему контролю швидкості протоки.

Один з найпростіших варіантів хемостату містить насос, постійно що постійно нагнітає живильне середовище в біореактор, і випускну трубу, по якій рідину з біореактора відбирають, якщо її рівень піднімається вище горловини. Альтернативний варіант - випускна труба входить в порожнину біореактора зверху і нижній обріз її горловини відповідає рівню, вище якого рідина не повинна підніматися. Якщо цей рівень перевищений, надлишок культурального середовища з клітинами відбирається насосом, приєднаним до випускної труби.

Турбідостатний режим культивування заснований на прямому контролі концентрації біомаси. Найбільш поширене вимірювання світлорозсіювання вмісту біореактора з допомогою фотоелементу. Сигнал від фотоелементу управляє швидкістю протоку рідини, що у свою чергу визначає швидкість росту культури. Підвищення концентрації клітин і відповідно світлорозсіювання автоматично призводять до прискорення протоку рідини, що розбавляє культуру, і, навпаки, спад біомаси компенсується уповільненням протоку.

Концентрація клітин може оцінюватися також за непрямими критеріями (по вимірюванню рН, убутку субстрату або накопичення продуктів життєдіяльності). Безперервне культивування, здійснене в одному біореакторі, позначається як одностадійне. Багатостадійне культивування з послідовним або каскадним розташуванням реакторів дозволяє впровадити принцип диференційованих режимів у безперервні біотехнологічні процеси. Ці диференційовані режими не змінюють один одного в часі, а одночасно здійснюються в послідовно розташованих апаратах. Наприклад, у першому з біореакторів створюють оптимальні умови для росту культури, а в другому - для біосинтезу цільового продукту.

Мета: дати уявлення про методи, інструментальне оформлення та можливості методу проточних культур.

Матеріали та обладнання:

1.Лабораторний ферментаційний комплекс «Bio-Flo»;

2.Стерильні розчини для приготування живильного середовища;

3.Інокулят (посівна культура);

4.ФЕК;

5.Скляний посуд, колби, мірні склянки, піпетки, бюкси.

Хід роботи:

1. У мікробіологічному боксі (або боксі-ламінарі) з маточних стерильних розчинів приготувати 1 л живильного середовища;

66

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

2.У оброблену УФ-опромінювачами кімнату внести необхідне обладнання (середовище, інокулят);

3.Посуд з середовищем з'єднати з насосом-дозатором, підключеним до ферментеру;

4.У ферментер влити інокулят (1 л);

5.Включити аеропомпу;

6.Включити систему перемішування і термостабілізації;

7.Виміряти вихідну оптичну щільність (ОЩ) інокуляту;

8.Фіксувати в робочому журналі температуру культури;

9.При досягненні температури 30ºС почнеться ріст культури;

10.Періодично (через 30 хв.) відбирати проби для визначення оптичної щільності культури. При оптичній щільності культури 0,1 (без

розведення) включити насос-дозатор на мінімальну швидкість протоку (0,1 год-1);

11.Щогодини визначати ОЩ культури;

12.При збільшенні ОЩ поступово збільшувати швидкість протоку середовища до стану steady-state (величина Х, г/л - постійна);

13.Обчислити значення питомої швидкості росту культури, визначити час досягнення стану steady-state, отримати культуру (зберігати

вхолодильнику) для наступних занять.

Контрольні питання :

1.У чому принципова відмінність проточної культури від періодичної?

2.Які основні вимоги до організації проточної ферментації?

3.Які переваги проточної культури?

Робота № 14. Проведення процесу ферментації з лімітуванням субстрату

Процеси мікробного синтезу діляться на два типи: 1) процеси, пов’язані з ростом біомаси, що відбуваються паралельно зі швидкістю розмноження клітин, і 2) процеси, що відбуваються або прискорюються при уповільненні швидкості росту клітин.

Оптимізація обох типів процесів здійснюється різними шляхами в залежності від того, наскільки співпадають (або не співпадають) оптимізація швидкості росту зі швидкістю синтезу макромолекул тієї чи іншої природи.

Процес росту – це процес синтезу первинних метаболітів (амінокислот, органічних кислот, вітамінів, нуклеотидів, проміжних продуктів катаболізму) і їх збирання в основні клітинні макромолекули (білки, нуклеїнові кислоти, полімери, що утворюють клітинну стінку). Ріст і синтез цих продуктів максимальний, коли клітина максимально забезпечена субстратом. У періодичній культурі це має місце в

67

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

експоненціальній фазі росту. Таким чином, оптимізація процесу накопичення максимальної біомаси клітин у культурі та синтезу первинних продуктів обміну зводиться до оптимізації умов живлення і створенню умов збалансованого росту для культури. Накопичення продуктів обміну, що відбуваються в другій фазі розвитку культури (кінець лінійної – стаціонарна фаза) - запасних сполук (поліфосфатів, поліцукрів, ліпідів) або вторинних продуктів обміну (антибіотиків, терпенів, стероїдів), має для промислової біотехнології велике значення. Накопичення запасних сполук у клітинах має місце при незбалансованому рості внаслідок вичерпання із середовища певних елементів живлення і лімітування процесу синтезу основних макромолекул. Синтез вторинних продуктів обміну (ідіолітів) має місце у випадку уповільнення і зупинки росту клітин в кінці розвитку популяції (кінець стаціонарної фази - фаза відмирання), коли відбувається дерепресія ферментів, які каталізують реакції утворення даних сполук і репресованих на стадії збалансованого росту. Оптимізація процесу синтезу запасних сполук і вторинних метаболітів більш складна, оскільки вимагає спеціальних знань про закономірності утворення тих чи інших макромолекул і специфічних підходів у кожному конкретному випадку.

При лімітування росту мікроорганізмів окремими елементами мінерального живлення відбувається уповільнення швидкості росту клітин, що супроводжується значними змінами хімічного складу, головним чином, співвідношення основних і запасних макромолекул. Виявлення принципіальних закономірностей цих змін відкриває широкі можливості для спрямованої зміни складу мікробної біомаси та цільового отримання конкретних продуктів мікробіологічного синтезу. Більше того, крім зміни спрямованості біохімічної програми синтезу основних і запасних сполук лімітування росту клітин тим чи іншим мінеральним елементом дозволяє додатково регулювати хімічну структуру окремих сполук, що входять до складу клітин.

Відправним моментом є зміна співвідношення C/N в живильному середовищі. Клітини, лімітовані по азоту і не здатні синтезувати основні сполуки (білки і нуклеїнові кислоти), споживаючи вуглець, направляють його на утворення різних безазотистих сполук вуглецевої і ліпідної природи. Якісний склад запасних сполук, синтезованих при лімітуванні росту мікроорганізмів по азоту на фоні збільшення вмісту вуглецю (збільшення відношення C/N), визначається специфікою фізіологобіохімічних властивостей конкретних мікробних видів, а також штамів.

Мета: освоєння техніки ведення процесу вирощування мікроорганізмів з лімітуванням субстрату для знаходження умов росту, що впливають на біохімічну програму синтезу макромолекул.

Матеріали та обладнання:

1. Музейна культура штаму R. eutrophus B-5786;

68

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

7.Провести посів культури в ферментер для періодичного вирощування бактерій, відбір проб і визначення в них інтенсивності світіння і оптичної щільності.

8.Провести відбір проб з ферментера, визначення світіння і оптичної щільності. Провести злив ферментера, підготовку до стерилізації та стерилізацію ферментера. Розрахунок умов безперервного культивування клітин.

9.Посіяти культури в ферментер для безперервного культивування бактерій, відібрати проби для визначення оптичної

щільності і світіння. Перевести культури на безперервний процес вирощування, зробити відбір проб, проведення аналізів, побудову графіків кривої росту культури.

10. Провести злив ферментера, розбирання та миття, відділення біомаси, руйнування на пресі або ультразвуком, визначення ферментативної активності і кількості АТФ.

Контрольні питання:

1.У чому специфіка метаболізму воденьокиснюючих хемоавтотрофних мікроорганізмів?

2.У чому основні труднощі культивування газовикористовуючих мікроорганізмів?

3.Що дозволяє фіксувати в ході культивування водневих бактерій метод Шлегеля?

70