Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

Періодичний процес включає: а) стерилізацію середовищ, біореакторів та допоміжного обладнання; б) завантаження апарату живильним середовищем; в) внесення посівного матеріалу (клітин, спор); г) ріст культури, який може збігатися в часі з наступним етапом або передувати йому; д ) синтез цільового продукту; е) відділення і очищення готового продукту. Мова йде про обмежені в часі послідовності етапів, по закінченні останнього етапу біореактор очищується і його готують до нового циклу.

Під час культивування всі параметри безперервно змінюються. Розвиток керованих періодичних процесів призвело до створення об'ємнодоливної системи: в процесі культивування головні компоненти середовища додають по частинам, чим виключають субстратне інгібування. Рідкі компоненти з середовища не відводять. Широко застосовують періодичне культивування з підживленням: внесення поживного субстрату в реактор до введення в нього біооб'єкту, в процесі культивування в апарат додають поживні речовини через певні проміжки часу порціями або безперервно «по краплях». Іноді додатково вносять біооб'єкти.

Існує також від’ємнодоливне культивування, коли частина обсягу з біореактора час від часу вилучається при додаванні еквівалентного об'єму середовища. Це призводить до регулярного омолоджування культури і до затримки переходу до фази відмирання. Такий режим культивування значною мірою уподібнюється безперервному процесу, тому називається також напівбезперервним культивуванням. При отриманні мікробних білкових препаратів часто застосовують безперервне культивування як більш економічне і легше контрольоване. Концентрація поживних речовин навколо клітини повинна знаходитись в межах допустимої області і не сприяє побічним реакціям, які можуть призвести до утворення осаду на стінках ферментера.

Відкриті системи працюють в безперервному потоці. Забезпечується безперервний приплив свіжого живильного середовища в біореактор і відтік з нього культуральної рідини з клітинами і продуктами їх життєдіяльності. В одиницю часу субстрату вводять не більше, ніж може переробити культура. Проводять безперервне культивування принаймні з однією лімітуючою ріст концентрацією речовини. Регулювання здійснюють підтриманням концентрації біомаси або продукту на постійному рівні шляхом зміни концентрації субстрату (турбідостат) або застосування точно лімітованої концентрації поживних речовин з відповідною зміною концентрації клітин або продукту (хемостат).

У безперервних процесах культура постійно підтримується в експоненційній фазі росту. Фундаментальним принципом безперервних процесів служить рівновага між приростом біомаси за рахунок поділу клітин і їх зменшенням у результаті розведення свіжим середовищем.

51

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

Робота № 8. Фази росту культур-продуцентів

ірозрахунок кінетичних параметрів

Упростій гомогенній періодичній культурі всі її частини знаходяться

воднакових умовах. Різні фази росту такої культури відображають зміни в біомасі і в навколишньому середовищі.

Етап росту культури включає кілька фаз (рис.18).

Рис. 18. Типовий ріст бактеріальної популяції

(За Тейлор Д.та ін., 2005)

У лаг-фазі відбувається перепад концентрацій елементів живлення, особливо вуглецевого, від знижених - у накопичувальній культурі, з якої відбирається посівний матеріал, до високих - у свіжому середовищі. У ході лаг-фази бактерії адаптуються до нового середовища існування, і максимальна швидкість росту не досягається. Виснажені клітини старого посівного матеріалу повинні перейти з стану росту при незначній концентрації живильних елементів до фази розмноження, яка визначається необхідними кількістю і станом рибосом, здатністю та умовами до реплікації хромосом, синтезу клітинної стінки і т. д. У цей період у клітинах бактерій можуть, наприклад, синтезуватися нові ферменти, необхідні для засвоєння тих живильних речовин, які присутні в новому середовищі.

Наступна фаза — логарифмічна, коли бактерії ростуть із максимальною швидкістю, число бактерій збільшується майже експоненційно, тобто крива росту являє собою майже пряму лінію. У цій фазі зведені до мінімуму всі лімітуючі і інгібуючі впливи (компоненти живильного середовища в надлишку, продукти обміну не накопичилися). Ріст культур відбувається з максимально можливою швидкістю, генетично закладеною в клітинах. Якщо середовище за своїм початковим складом не оптимальне, то ріст буде обмежений невідповідним живленням або неоптимальним значенням рН і т. д.

52

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

У цьому випадку ріст може бути описаний більш пологою експонентою або прямою. Ця фаза в лабораторних умовах не може бути тривалою, так як навіть не дуже щільна популяція незабаром почне відчувати нестачу в кисні через його швидке поглинання і слабку розчинність. Фаза уповільнення росту може бути дуже різноманітною і самою складною. Вона може бути повністю відсутньою на простих синтетичних середовищах, коли ріст відразу зупиняється через відсутність одного елемента живлення, особливо - джерел вуглецю та енергії. У ході цієї фази час подвоєння залишається постійним і має мінімальне значення.

Згодом ріст колонії починає вповільнюватися, час подвоєння починає збільшуватися, і культура входить у стаціонарну фазу, швидкість росту популяції дорівнює нулю й різко зростає конкуренція за харчові ресурси. Утворення нових клітин уповільнюється і потім зовсім припиняється. Будь-яке збільшення числа клітин компенсується одночасною загибеллю інших клітин, тому сумарна чисельність живих клітин залишається постійною. Перехід до цієї фази визначається дією ряду факторів: виснаженням необхідних поживних речовин, нагромадженням токсичних продуктів розпаду, таких як спирт, а у випадку аеробних бактерій ще й обмеженням доступу кисню. Ріст бактерій уповільнюється також при зміні рН. На складних середовищах, що містять кілька джерел вуглецю, може відбуватися почергова їх утилізація та поступове уповільнення росту. При надлишку елементів живлення ріст сповільнюється через накопичення продуктів метаболізму. Токсичні продукти метаболізму у мікроорганізмів вельми різноманітні. Можливо одночасне отруєння та голодування. Відповідно з цим і стаціонарна фаза може містити самі різноякісні клітини: живі, й ті, що голодують, живі, але інгібовані, що відмирають унаслідок голодування або отруєння.

Стаціонарна фаза не характеризує культуру, так як у цей період стан клітин може бути найрізноманітнішим. Тільки експоненційна фаза певною мірою характеризує властивості культури.

Під час останньої фази — фази уповільнення росту — зростає швидкість загибелі клітин, і вона стає вищою, ніж швидкість розмноження. Згодом клітини взагалі припиняють відтворюватися.

Біотехнологічно цінні продукти синтезуються в експоненційній фазі (нуклеотиди, багато ферментів, вітаміни - так звані первинні метаболіти) або в стаціонарну фазу росту (антибіотики і т.д. - так звані вторинні метаболіти або ідіоліти) (див.Додатки). Первинні метаболіти — це продукти метаболізму, необхідні для росту і виживання. Вторинні метаболіти — продукти метаболізму, які не потрібні для росту та не істотні для виживання. Проте вони виконують корисні функції й часто захищають від дії інших конкуруючих мікроорганізмів або пригнічують їхній ріст. Деякі з них токсичні для тварин, тому вони можуть використовуватися в якості хімічної зброї. У найбільш активні періоди росту найчастіше вони не утворюються, але починають вироблятися при вповільненні росту, коли

53

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

стають доступними резервні матеріали. Вторинними метаболітами є деякі важливі антибіотики.

Таким чином, властивості клітин періодичної культури зазнають значних змін протягом усіх фаз росту, зумовлені безперервними змінами навколишнього середовище та швидкою реакцією на них клітин. Проте періодичні методи культивування мікроорганізмів широко використовуються в даний час в промисловій біотехнології і дослідницькій практиці. Техніка періодичної культури дозволяє отримати вихідні дані, та витратні коефіцієнти, і кінетичні характеристики культури, необхідні для переходу до проточних систем і масштабування процесу.

Мета роботи: ознайомлення з циклом розвитку мікробних культур і специфікою фаз періодичної культури.

Матеріали та обладнання:

1.Музейна культура штаму роду Pseudomonas;

2.Стерильний розчин базового фосфатного буфера для середовища;

3.Маточні стерильні розчини мікроелементів, заліза лимонно-кислого, сульфату магнію та хлористого амонію;

4.Шпателі, спиртівка, мірний посуд, піпетки, колби для вирощування бактерій, гумові пробки з мікробіологічними фільтрами;

5.Термостатуєма качалка.

Хід роботи:

1. Приготувати живильне середовище для вирощування бактерій:

-В мікробіологічному боксі до 0,5 л основного середовища (фосфатний буфер) в стерильних умовах над спиртівкою додати 2,5 мл стандартного розчину заліза, 1,5 мл розчину мікроелементів, 2 мл розчину сульфату магнію і необхідний об'єм розчину хлориду амонію (в 1 мл якого затримується 100 мг солі); вуглецевий субстрат (з розрахунку 10 г/л фруктози);

-Інокулят розлити в 10 ферментаційних колб по 100 мл (10 колб для періодичної культури), використовуючи стерильний мірний посуд; колби підписати (наприклад, 1а, 1б, 1в і т. д.);

-Виміряти вихідну оптичну густину (ОГ) культури.

2.Колби встановити на качалку.

3.Періодично проводити відбір проб для вимірювання оптичної

щільності культури на ФЕК і мікроскопіювання клітин. У колби, призначені для підживлення, через 12, 24 і 36 годин після початку культивування внести додатковий субстрат (розчин фруктози з розрахунку

10 г/л).

4.Дані занести в табл. 7.

5.За результатами експерименту побудувати криві росту культур (за накопиченням біомаси в культурі) бактерій.

54

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

живильний склад, за основу якого прийнята сольове середовище Шлегеля:

Na2HPO4×H2O - 9,1; KH2PO4 - 1,5; MgSO4×H2O - 0,2; Fe3C6H5O7×7H2O - 0,025(г/л). Мікроелементи вводяться за прописом Хоагланда з розрахунку

3 мл стандартного розчину на 1 л середовища. Стандартний розчин містить: H3BO3 - 0,288; CoCl2×6H2O - 0,030; CuSO4×5H2O – 0,08; MnCl2×4H2O - 0,008; ZnSO4×7H2O - 0,176; NaMoO4×2H2O - 0,050; NiCl2 - 0,008 (г/л). В якості субстратів можуть бути прийняті хлористий амоній і фруктоза.

З ферментативного каталізу відомі дві принципово різні найпростіші кінетичні схеми, що призводять до дискримінуємих залежностей швидкості процесу від концентрацій двох субстратів. З урахуванням автокаталітичного процесу мікробного росту ці дві схеми можуть бути представлені в наступному вигляді:

S1+N↔S1N↔ S1S2N→2N+P (1),

S1+N↔S1N→X+P S2+X↔S2X→2N+P (2),

де S1, S2 - концентрації субстратів, N – ненасичена форма клітини, X - «насичена» форма клітини, здатна до поділу; P – продукт.

Механізм (1) включає дві оборотні рівноважні стадії приєднання субстратів (механізм потрійного комплексу). Механізм (2) включає стадії приєднання субстратів, які, принаймні, розділені однією незворотною стадією (пінг-понг-механізм).

Для механізму групи (2) характерна наступна залежність від концентрації субстратів:

(3)

де K1 і K2 - ефективні константи спорідненості мікроорганізму до субстратів S1 і S2. Для механізмів групи (1) рівняння питомої швидкості росту може бути записано у вигляді

(4)

Подальші дослідження зводяться до аналізу рівнянь (3) або (4).

Для цього проводять дослідження і будують залежність виду

μ=f(S1;S2) (Рис.19.)

Обробка експериментальних даних дозволяє отримати значення ефективних констант спорідненості мікроорганізму до субстратів в

обернених координатах. Точки (1 - 3, дані рис.20): 1 - Xфр = 1кг/м3; 2 - 2,5; 3 - 8.

56

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

Мета роботи: побудова моделі для розрахунку питомої швидкості росту біомаси в умовах збалансованого субстрату при гетеротрофному культивуванні бактерій Ralstonia eutropha.

Рис. 19. Зміна питомої швидкості росту сумарної біомаси від концентрації фруктози S1. Експериментальні точки (1-4): 1 - S2 = 1,2 кг/м3; 2 - 0,6; 3 - 0,4; 4 - 0,2

Рис. 20. Залежність кінетичних параметрів 1/μm від 1/Xаз

Матеріали та обладнання:

1.Музейна культура штаму Ralstonia eutrophus B-5786;

2.Стерильний розчин базового фосфатного буфера для середовища;

3. Маточні стерильні розчини мікроелементів, заліза лимоннокислого, сульфату магнію і хлористого амонію;

4.Шпателі, спиртівка, мірний посуд, піпетки, колби для вирощування бактерій, гумові пробки з мікробіологічними фільтрами;

5.Термостатуєма качалка.

Хід роботи:

1.Розділитися на 4 групи по числу заданих значень концентрації хлористого амонію в середовищі (0,2, 0,4; 0,6 і 1,2 кг/м3) і концентрації фруктози (1, 2, 4, 8 кг/м3).

2.Кожній групі приготувати варіанти живильного середовища для бактерій із заданим значенням концентрацій фруктози і азоту:

57

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

-в мікробіологічному боксі до 0,5 л середовища в стерильних умовах над спиртівкою додати 2,5 мл стандартного розчину заліза, 1,5 мл розчину мікроелементів, 2 мл розчину сульфату магнію і необхідний обсяг розчину хлориду амонію (в 1 мл якого міститься 100 мг солі);

-близько 200 мл середовища відлити;

-залишені 300 мл середовища засіяти інокулятом, для цього змити культуру з одного музейного "косяка" (використовувати шпателі);

-інокулят розлити в ферментаційні колби об'ємом 100 мл;

-колби щільно закрити пробками;

-колби підписати згідно номеру експерименту;

-на ФЕК виміряти оптичну щільність (без розведення) кожного інокуляту;

-колби встановити на качалку.

3.Після закінчення 15 годин культивування через кожні 30 хв. (здійснити чотири повторності) провести вимірювання оптичної щільності

культури та по калібрувальній кривій визначити концентрацію біомаси в культурі, а потім розрахувати питому швидкість росту μ, год-1.

4.Дані представити у вигляді графічної залежності (рис.1).

5.Побудувати залежності 1/μ = f (1/S1) і 1/μ = f (1/S2) і визначити вид механізму і константи, що входять до рівняння (3) або (4).

6.Оформити роботу і зробити висновки.

Контрольні питання:

1.Якими методами визначають питому швидкість росту мікроорганізмів?

2.Періодичне і безперервне культивування.

3.Моделі росту культури.

Робота № 10. Вивчення кінетики росту дріжджів при глибинній ферментації

Існує два способи культивування популяції мікроорганізмів у глибині рідкого середовища: періодичний і безперервний. Вид кривої росту дріжджів змінюється в залежності від умов культивування, але послідовність фаз залишається незмінною.

Для кількісної характеристики культивування мікроорганізмів користуються 2 показниками – середньою та питомою швидкістю росту. Середня швидкість росту V характеризується приростом біомаси за одиницю часу

де х0 – кількість біомаси на початку культивування, кг/м3; х – біомаса за час культивування, кг/м3; t0, t –початковий та кінцевий час відліку, год.

58

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

Для вивчення кінетики росту мікробної популяції в умовах глибинної ферментації використовують дріжджі роду Saccharomyces. Експериментальні дані для визначення технологічних показників процесу культивування отримують на лабораторній установці (рис.21).

Рис.21. Схема лабораторної установки для вирощування дріжджів:

1 – ультратермостат, 2 – фільтр очищення повітря; 3 – штуцер виходу повітря, 4- штуцер введення середовища та відбирання проб, 5 – електрод рН-метра, 6 – ємність культиватору, 7 – рубашка, 8 – барботер, 9 -іонометр, 10 –ротаметр, 11компресор.

Установка складається з ємності об'ємом 1 л для вирощування дріжджів (6), забезпеченою барботером (8) для рівномірного розподілу повітря, що нагнітається компресором (11). Відпрацьоване повітря очищається, проходячи систему фільтрів (2). Ємність культиватора забезпечена рубашкою (7), в яку подається вода від ультратермостату (1) для підтримки температури процесу вирощування. Рівні рН і температура середовища вимірюється електродом (5) іонометра (9). Витрата повітря встановлюється ротаметром (10).

Мета роботи: визначення основних технологічних характеристик періодичного процесу глибинної ферментації дріжджів.

Хід роботи:

1.Приготувати 1 л живильного середовища, наступного складу: цукор - 9%; діамоній фосфат - 0,3%; амоній сірчанокислий - 0,16%; хлористий калій - 0,06%; магній сірчанокислий - 0,02%. Заміряти величину рН розчину на іонометр і довести при необхідності до 4,5 70%-ною ортофосфорною кислотою або аміачною водою.

2.Провести асептичну обробку ємності культиватора етанолом. Після чого заповнити його живильним середовищем, відібравши в пробірку 15 мл вихідної суміші для визначення в ній вмісту цукру.

3.Включити ультратермостат і нагріти живильний розчин до температури 30-31°С. Після чого через штуцер (8) ввести через воронку засівну суспензію: дріжджів (посівного матеріалу) в кількості 12% до об'єму живильного середовища. Температура середовища протягом процесу, також як і рН середовища контролюється за допомогою іонометра, електрод якого постійно знаходиться в рідині.

59