Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

ДОДАТКИ

М’ясо-пептонний бульйон (МПБ):

1.До м’ясної води прибавляють 1% пептону і 0,5% хлориду натрію, кип’ятять протягом 1-2 хв. при помішуванні, потім охолоджують і визначають pH.

2.Внесенням лугу (20%-й NaOH) або 1 н кислоти встановлюють pH середовища 7,6-7,8. Кип’ятять протягом 30-45 хв., охолоджують, фільтрують через паперовий фільтр і доводять об’єм до початкового.

3.Перевіряють pH, доводять його до 7,2-7,4, розливають у колби і стерилізують при 1200 С протягом 15-20 хв.

М’ясо-пептонний агар:

1.До виготовлено й охолодженого МПБ прибавляють 1,5-2,0% агарагару, витримують протягом 15-20 хв. при кімнатній температурі (для набухання).

2.Суміш підігрівають на водяній бані до повного розчинення агарагару.

3.Охолоджують до 500 С і для просвітлення вносять у середовище ретельно збитий, у подвійному об’ємі холодної води, яєчний білок (білок 1 яйця на 1 л середовища). Прогрівають в автоклаві при 0,5 атм протягом 45 хв. Білок адсорбує звішені частинки, згортається й осідає на дно.

4.Середовище фільтрують через шар марлі або вати.

5.Перевіряють і доводять до необхідного значення pH середовища.

6.Середовище розливають у колби і стерилізують при 1200 С (1 атм) протягом 15-20 хв.

Пептонна вода (ПВ):

1.В 1 л дистильованої води розчиняють при нагріванні 100 г пептону, 50 г хлориду натрію, 1 г нітрату калію, і 20 г бікарбонату натрію.

2.Розчин фільтрують через паперовий фільтр, розливають у колби і

стерилізують при 1 атм протягом 30 хв.

Ґрунтовий агар (ГА):

1.З повітряно-сухого ґрунту видаляють рослинні рештки, кусочки скла та інших домішок.

2.Ґрунт розтирають у ступці, а потім просівають через сито з діаметром пор 1 мм.

3.Ґрунт поміщають у колбу і заливають дистильованою водою у співвідношенні 1:5. Суспензію ретельно перемішують, а потім прибавляють 1,5-2,0% агар-агару.

4.Середовище стерилізують в автоклаві при 1200 С протягом 1 год.

Стерилізацію повторюють через 1-2 доби.

Сусловий агар (СА):

1.Пивне сусло розводять до вмісту цукрів 7-80 за Баллінгом і стерилізують при 1200 С протягом 10 хв.

241

ДОДАТКИ

2.В 1 л охолодженого сусла прибавляють 1,5-2,0% агар-агару, витримують при кімнатній температурі протягом 15-20 хв.,

розплавляють середовище на водяній бані, розливають у колби і стерилізують при 1100 С протягом 10 хв.

Середовище Сабуро:

1.В 1 л водопровідної води вносять 80 г пресованих пекарських дріжджів (або 20 г сухих дріжджів).

2.Кип’ятять протягом 15 хв., фільтрують через паперовий фільтр.

3.У холодну дріжджову воду вносять 1,5-2,0% агар-агару і витримують протягом 15-20 хв. при кімнатній температурі, а потім плавлять на водяній бані, прибавляючи 1% пептону і 4% глюкози (або мальтози).

4.Середовище фільтрують через шар вати, розливають у колби і

стерилізують при 0,5 атм протягом 20 хв.

Середовище Чапека:

1.В 1 л водопровідної води внести при перемішуванні:

-глюкозу (сахарозу) - 30,0 г

-натрій азотнокислий - 2,0 г

-калій фосфорнокислий однозаміщений – 1,0 г

-магній сірчанокислий – 0,5 г

-калій хлористий – 0,5 г

-залізо сірчанокисле – 0,01 г

-агар-агар – 20,0 г

2.Середовище стерилізують протягом 10 хв. при 116,50 С (0,75 атм) в автоклаві.

Середовище Ендо:

Поживне середовище Ендо випускається у вигляді сухого порошку і готується згідно пропису, вказаного на етикетці.

Середовище Ешбі:

Для виготовлення синтетичного середовища Ешбі, яке призначене для культивування азотфіксуючих бактерій, на 1 л водопровідної води добавляють:

-калій фосфорнокислий двозаміщений 0,2 г

-магній фосфорнокислий – 0,2 г

-калій фосфорнокислий 0,1 г

-натрій хлористий – 0,2 г

-крейду – 5,0 г

-сахарозу – 20 г

-агар-агар – 20 г.

Крохмале-аміачний агар – найбільш поширене середовище для підрахунку стрептоміцетів в грунті:

-амоній сірчанокислий – 2,0 г

-калій фосфорнокислий двозаміщений – 1,0 г

-магній сірчанокислий – 1,0 г

242

ДОДАТКИ

-натрій хлористий – 1,0 г

-крейду – 3,0 г.

-розчинний крохмаль – 10,0 г

-агар-агар – 20 г

Крохмаль попередньо розмішують у невеликій кількості води, а потім доливають до основного середовища

Цикл перетворень вуглецевмісних сполук складний. У ньому беруть участь мікроорганізми, що розкладають органічні речовини з утворенням різних проміжних і кінцевих продуктів. Ці мікроорганізми відносяться до різних фізіолого-трофічних груп, а їх виділення можливе при висівах матеріалу на середовища, в яких єдиним джерелом вуглецю є органічні речовини.

Серед усієї маси мікроорганізмів, що беруть участь у кругообігу вуглецю, найважливішу роль відіграють оліготрофи, гетеротрофи, дріжджі, стрептоміцети (актиноміцети), мікроміцети (гриби), що розкладають целюлозу, пектинові речовини, жири, вуглеводи.

Олігокарбофіли — одна з найменш вивчених груп мікроорганізмів, життєдіяльність яких забезпечується малою кількістю поживних речовин. Їх виділення і кількісний облік роблять на голодному агарі — агаризованій водопровідній воді, агаризованій воді з досліджуваної водойми чи агаризованому екстракті з ґрунту (дивись нижче). Агар для приготування середовища має бути ретельно відмитий (вилужений). Середовище розливають у стерильні пляшки і автоклавують 20 хв. при тиску 1·105 Па.

Посів роблять глибинним методом заливання в агар, інкубують при температурі не вище 28 °С. Облік і опис колоній роблять через 48-72 год. Колонії оліготрофів поверхневі, дрібні, круглі, а за забарвленням — молочно-білі, сірі чи зовсім безбарвні.

Серед мікробного населення ґрунтів і водойм певне місце займають

бактерії, здатні продукувати біологічно-активні речовини, необхідні для нормальної життєдіяльності біоти. Для вилучення цих мікроорганізмів та встановлення їх кількості надійні результати дає застосування глюкозо-

мінерального середовища Красильникова, яке має такий склад:

243

ДОДАТКИ

Усі солі для приготування цього середовища мають бути марки «чда», глюкоза — в ампулах для ін’єкцій, агар — ретельно відмитим кілька годин у дистильованій воді.

Важливою складовою мікробних угруповань ґрунтів і водних об'єктів є актиноміцети, гриби(мікроміцети) і дріжджі, чисельність яких значно зростає при низькому значенні рН, нестачі азоту і значних запасах органічних речовин. Кількість їх враховують на агаризованих середовищах Чапека-Доксе і середовищі Ваксмана в модифікації Мартинова.

Можна використовувати також елективні середовища з різним джерелом вуглецю, селективні середовища з лігніном, різними інгібіторами бактерій тощо. Зберігати чисті культури до їх ідентифікації

Усі інгредієнти, крім глюкози, розчиняють у дистильованій воді, нагріваючи її текучою парою.

Середовище фільтрують через вату і стерилізують в автоклаві 1 год. при тиску 7·104 Па.

Перед вживанням до середовища додають розчин глюкози, попередньо простерилізований при 100 °С.

Повністю готове середовище стерилізують 30 хв. при 100 °С текучою парою.

Середовище Ваксмана в модифікації Мартинова

(рН 6,3-7,0)

Для приготування ґрунтового екстракту 500 г орного ґрунту або донних відкладень водойми заливають 1200 мл дистильованої води і кип'ятять

244

ДОДАТКИ

протягом 1 год. Фільтрують через вату і доводять дистильованою водою до 1 л, стерилізують в автоклаві 30 хв. при тиску 1·105 Па.

Усі інгредієнти крім глюкози і стрептоміцинсульфату розчиняють у ґрунтовому екстракті й стерилізують в автоклаві 20 хв. при тиску 7·104 Па. Далі чинять так само, як і з середовищем Чапека-Доксе. Перед розливанням у чашки середовище охолоджують до 70 °С і додають стрептоміцинсульфат.

У чашках із середовищем Чапека-Доксе через 28-30 год. підраховують жовто-білі чи жовті опуклі колонії дріжджових грибів і через 7-10 днів колонії цвілевих грибів. Середовище Ваксмана в модифікації Мартинова слугує контрольним, тому що на середовищі Чапека-Доксе ріст

Зазначені інгредієнти додають до дистильованої води і кип'ятять протягом 1 год. Середовище фільтрують через вату і стерилізують 3 дні текучою парою по 30 хв.

При виділенні й кількісному обліку у водоймах дріжджів можуть бути застосовані також інші середовища.

Середовище для дріжджів із суслом і сахарозою (рН 6,8-7,0)

Середовище треба стерилізувати текучою парою або 20 хв. в автоклаві при тиску 7·104 Па.

Середовище для дріжджів із глюкозою (рН 6,8)

245

ДОДАТКИ

Дріжджовий відвар отримують при кип'ятінні 200 г пресованих дріжджів у 1 л водопровідної води.

Існує кілька способів приготування дріжджового автолізату. При автолізі дріжджів під впливом протеаз, що містяться в них, більша частина білків переходить у розчин у вигляді пептонів і альбумоз.

Заспособом Омелянського для отримання автолізату 1 кг пресованих дріжджів треба залити 1 л кип’яченої води з температурою 60 °С, розмішати в гомогенну масу, нагріти її на водяній бані до 50 °С. При цій же температурі інкубувати у термостаті протягом 3 діб. Після цього проавтоклавувати 30 хв. при тиску 2·104Па і кілька разів профільтрувати до одержання прозорої рідини. У ній міститься 0,9 % азоту. Осад переносять з фільтра в колбу, заливають 600 мл води, збовтують і знову відфільтровують. Обидва фільтрати змішують. Вміст азоту в суміші коливається від 0,6 до 0,8 %. Фільтрат нейтралізують до рН 6,8, розливають у стерильний посуд і автоклавують 15 хв. при тискові 7·104 Па.

За способом Скородумової 500 г пресованих дріжджів треба залити рівною кількістю води, розмішати і витримати в термостаті 2-3 доби при 45 °С. Потім профільтрувати, а осад на фільтрі промити 1 л води. Отриманий фільтрат розбавити водою до 2 л, розлити в стерильний посуд і автоклавувати 30 хв. при тискові 1·105 Па.

За способом Плотникової для отримання автолізату 100 г пресованих дріжджів заливають 300 мл води, перемішують і витримують у термостаті 2 доби при 53-56 °С, періодично перемішуючи. Потім додають 200 мл води і фільтрують. Стерилізують в автоклаві 30 хв. при тиску 7·104 Па.

За способом Санкт-Петербурзького інституту вакцин і сироваток 1 кг пресованих дріжджів заливають 500 мл водопровідної води (при температурі 45 °С), яка вміщує 10 г цукрового піску. Інкубують протягом доби при 50 °С. Потім відфільтровують і стерилізують текучою парою.

За Кудрявцевим для отримання автолізату 400 г пресованих дріжджів заливають 1 л води і, періодично збовтуючи, інкубують 2 доби при температурі 48 °С. Після цього фільтрують і стерилізують текучою парою чи в автоклаві при 5·104 Па.

За Одинцовою пресовані хлібопекарські чи пивні дріжджі потрібно добре промити і розбавити водою до консистенції сметани. Потім підкислити розведеною сірчаною кислотою до рН 6,0 і витримати в термостаті 20 год. при 48 °С, після чого кип'ятити протягом 5 хв., відстояти і профільтрувати.

Неохмелене солодове сусло отримують з пивоварних заводів. Для приготування живильних середовищ його розбавляють водою у 2 рази.

246

ДОДАТКИ

Після цього його щільність за Баллінгом близька до 8°. Можна отримати сусло й у лабораторії.

За Омелянським 1 л води слід нагріти до 48-50 °С і при постійному помішуванні, щоб уникнути утворення грудочок, всипати 250 г меленого солоду. При цій же температурі витримати 30 хв. Потім підвищити температуру до 55-58 °С й підтримувати її стільки часу, скільки буде потрібно для повного оцукрення крохмалю, тобто доти, доки остигла рідина не перестане давати посиніння з йодом. Піднімати температуру не можна, тому що при цьому руйнуватиметься амілаза. У результаті виходить мутна рідина. При відстоюванні в ній утвориться багато осаду. Рідину можна декантувати, користуючись ділильною лінійкою, чи процідити крізь сито з отворами не більше 1 мм. Розливати її слід у стерильний посуд, намагаючись не забруднити горлечка, щоб не прилипали пробки. Стерилізувати сусло краще в апараті Коха протягом 3 діб по 30 хв. На четверту добу за кілька годин до стерилізації рідину прогрівають при 35-40 °С. На п'яту добу її витримують без стерилізації при 25-30 °С. Остання стерилізація проводиться на добу і триває 1 год. У проміжках між етапами стерилізації сусло витримують на холоді. Можлива також стерилізація в автоклаві протягом 15-20 хв. при тиску

4·104 Па.

Для вивчення характеру спороутворення у дріжджів

рекомендується культивувати їх на агарі Городкової.

Агар Городкової в модифікації Лоддер та Крегер Ван Рий

У ґрунтовій мікробіології кращими середовищами для виділення і кількісного підрахунку дріжджів вважаються сусло-агар, підкислений молочною кислотою з розрахунку 3 мг/л, солодовий агар, агар Сабуро і середовище Ваксмана. Для обліку олігонітрофільних дріжджів частіше використовують середовище Ешбі із сахарозою. Для придушення росту бактерій і актиноміцетів у зазначені середовища додають органічні й мінеральні кислоти, антибіотики і барвники. З інших середовищ, придатних для культивування дріжджів, варто вказати середовище Цетліна

247

ДОДАТКИ

та Охмана. Останнє містить такі компоненти, як гліцерин, натуральні соки і витяжки з листків буряка.

Вивчення засвоєння дріжджами вуглеводів найзручніше проводити на середовищі Кудрявцева.

Кислотність середовища 5,8-5,9. На кожні 100 мл середовища додають по 3 мл 0,04%-го розчину індикатора бромтимолового синього.

Можливо застосувати також середовище Лоддер і Крегер Ван Рий.

Середовище Лоддер і Крегер Ван Рий

До цього середовища слід додати 0,05 мл концентрованого в 100 разів розчину. Його склад такий:

248

ДОДАТКИ

Під час приготування цього середовища розчин вітамінів може бути замінений дріжджовою водою, розчинивши 200 г пресованих дріжджів в 1 л дистильованої води. Цей розчин витримують 15 хв. в автоклаві при тиску 9·104 Па і двічі фільтрують. Зберігають у холодильнику.

Для вивчення засвоєння дріжджами різних джерел азоту можна

Для виділення і кількісного обліку цвілевих грибів найчастіше застосовують середовищеЧапека,атакожсередовищеФредаіВаксманазрН5,6.

Розчинтребапрофільтрувати,рНможнаневстановлювати.

Середовище Фреда і Ваксмана

Для виділення, кількісного обліку і вивчення актиноміцетів існує досить багато середовищ, що відрізняються за рецептурою і рН. Найпростіше з них – картоплянийагар.

Картоплю треба очистити, дрібно нарізати і варити протягом 30 хв. Рідину профільтрувати через вату з марлею, додати до неї агар і нагрівати до повного його розплавлення. Потім установити рН 7,0, розлити в стерильний посуд і стерилізувати 1 год. при тиску 9 104 Па.

249

ДОДАТКИ