Глава 5. Биолюминесценция бактерий

Способностью к биолюминесценции обладают многие организмы – бактерии, грибы (Armillaria mellea, Panus stipticus и др.), водоросли, насекомые, моллюски и рыбы. Ферменты, субстраты и механизмы реакций, которыми обусловлено свечение этих организмов, существенно различаются, но во всех случаях реакция, приводящая к эмиссии света, требует участия О₂. Светящиеся бактерии встречаются в морских, пресноводных и наземных экосистемах. Они могут быть свободноживущими сапрофитами или симбионтами, обитающими в пищеварительном тракте и святящихся органах костистых рыб и кальмаров.

Светящиеся бактерии легко выделить из морской и солоноватой воды. На мясе и рыбе они образуют естественные накопительные культуры, особенно при низких температурах. Если морскую рыбу в неглубокой посуде наполовину залить соленой водой и оставить на несколько дней в холодильнике при 4 – 6 ºС, то на поверхности рыбы появятся колонии светящихся бактерий, которые можно выделить и получить в чистой культуре.

Большинство светящихся бактерий относится к родам Photobacterium и Vibrio. Это грамотрицательные, факультативно анаэробные, хемоорганотрофные, передвигающиеся с помощью перитрихиально или полярно расположенных жгутиков. Морские светящиеся бактерии являются галофилами; если поместить их в гипотеническую среду, они быстро лизируются.

В анаэробных условиях большинство светящихся бактерий осуществляют брожение смешанного типа, при котором образуются муравьиная, молочная, уксусная и янтарная кислоты, этанол, СО₂ и ацетоин.

Рост светящихся бактерий и их биолюминесценция в сильной степени зависят от состава среды, в которой они находятся. Свечение наблюдается только в присутствии молекулярного кислорода, поэтому светящиеся бактерии еще в конце XIX века использовались как чувствительные индикаторы для выявления фотосинтетического образования кислорода у зеленых и красных водорослей в опытах со светом разной длины волны.

Интенсивность люминесценции у большинства светящихся бактерий четко зависит от плотности клеток в культуре: свечение густых культур может в 1000 раз превышать свечение разбавленных культур в расчете на одну клетку. Исследование этого эффекта у симбиотических бактерий Vibrio fischeri показало, что регуляция свечения, зависящая от плотности клеток (эффект «кворум-сенсинг»), происходит на уровне транскрипции. Клетки бактерий V. fischeri конститутивно синтезируют и выделяют в среду небольшое количество сигнального соединения – аутоиндуктора. Он накапливается в среде, по-видимому, пропорционально скорости роста и плотности бактерий. При высокой плотности клеток достигается пороговая концентрация аутоиндуктора, в которой он способен индуцировать люминесценцию. Легко проникающий через клеточную мембрану аутоиндуктор связывается в клетках с белком – регулятором траскрипции Lux R, который активирует экспрессию генов lux CDABEGH, ответственных за люминесценцию. У симбиотических светящихся бактерий V. fischeri эффект регуляции, зависящей от плотности, проявляется, когда при размножении в ограниченном пространстве светящегося органа рыб их популяция достигает высокой плотности. Аналогичный тип ауторегуляции обнаружен и у свободноживущих светящихся бактерий, однако плотность популяции этих бактерий в природе обычно не достигает той, которая необходима для индукции люминесцентного комплекса.

Бактериальная система биолюминесценции включает фермент люциферазу и ферментный комплекс, называемый редуктазой жирных кислот. Синтез этих ферментов, например, у бактерий рода Vibrio, детерминируется локусом lux CDABEGH. Входящие в состав этого локуса гены lux AB – это структурные гены, ответственные за синтез фермента люциферазы; гены lux CDE кодируют комплекс ферментов восстановления жирных кислот; продукты генов lux GH необходимы для восстановления флавина.

Реакцию в результате которой происходит свечение (фотоэмиссия), катализирует люцифераза – монооксигеназа, осуществляющая сопряженное окисление НАДФН и длинноцепочечного альдегида (R–CHO) молекулярным кислородом. Реакция сопровождается эмиссией голубовато-зеленого света (длина волны 490 нм).

НАДФН + R–CHO + О₂ → НАДФ⁺ + Н₂О + R–COОН + фотон

Свободная энергия, выделяющаяся в этой окислительно-восстановительной реакции, расходуется не на синтез АТФ, как в реакциях аэробного дыхания, а на свечение. Люцифераза локализована в цитоплазме и характеризуется сравнительно низкой скоростью оборота (1 – 0,1 сек^-1). Она содержит связанный флавинмононуклеотид (ФМН), восстановление которого обеспечивается НАДФН. В восстановленной форме флавин мононуклеотид ФМНН₂ окисляется О₂ с образованием пероксида флавинмононуклеотида и стабильного промежуточного продукта – комплекса с альдегидом. После окисления субстратов комплекс медленно распадается, высвобождая продукты. На этой стадии происходит эмиссия света:

R–CHO R–COОН

ФМНН₂ + Е + О₂ → Е–ФМНН R–COОН + Е + ФМН +Н₂О + фотон,

ООН

где Е – люцифераза, ООН – гидроперекисная группа, R–CHO – алифатический альдегид, R–COОН – жирная кислота, образующаяся при окислении альдегида.

Участвующий в люциферазной реакции альдегид образуется из соответствующей жирной кислоты под действием редуктазного комплекса, состоящего из синтазы, трансферазы и редуктазы:

R–COОН + АТФ + НАДФН → НАДФ⁺ + АМФ + Ф_н + R–CНО

Синтаза активирует жирную кислоту, присоединяя к ней АМФ. Ацетильная группа переносится на редуктазу, где с участием НАДФН происходит ее восстановление до альдегида, который высвобождается из ферментного комплекса. Интенсивность свечения зависит от концентрации АТФ и НАДФН, потребляемых в реакции.

В последние годы получают все большее распространение методы исследований, основанные на биолюминесценции, в которых в качестве тест-объектов используют бактериальные суспензии, экстракты светящихся бактерий, изолированный фермент люциферазу.

Прежде всего, измерение биолюминесценции бактерий можно использовать для определения низких концентраций кислорода, так как при отсутствии кислорода светящиеся бактерии не способны к эмиссии света. Она усиливается пропорционально концентрации кислорода в среде в интервале концентраций О₂ от 2∙10^-8 до 5∙10^-6 моль/л.

Можно использовать светящиеся бактерии и в качестве живых организмов, на которых изучают действие различных токсических веществ. Светящиеся бактерии чувствительны к примесям токсических веществ в воде, и измерение биолюминесценции можно использовать для определения загрязнения воды токсическими соединениями, например ионами тяжелых металлов. Свечение бактерий можно использовать для предварительной оценки эффективности новых антибиотиков.

Но наиболее перспективно применение очищенных препаратов бактериальной люциферазы. Фермент, очищенный от примесей низкомолекулярных соединений, обладает способностью к излучению света лишь в присутствии всех трех субстратов: кислорода, ФМНН₂ и длинноцепочечного альдегида (с длиной цепи не менее восьми углеродных атомов). Добавив к изолированной бактериальной люциферазе ФМНН₂, можно получить высокочувствительную систему для определения алифатических альдегидов. К их числу принадлежат, в частности, половые гормоны насекомых, феромоны, которые обнаруживаются в количестве 10^-14 моля, что позволяет изучать метаболизм этих веществ у одной особи. В медицине найдет также широкое применение анализ содержания ФМН и ФАД, основанный на биолюминесцентном определении ФМНН₂, образующегося при их предварительном восстановлении. Наиболее перспективными для использования в биохимических и клинических лабораториях являются препараты, состоящие из двух ферментов: бактериальной люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы. Например, к комплекте реактивов для анализа биолюминесценции (КРАБ), производимом в России, содержатся люцифераза и оксидоредуктаза, выделенные из биомассы светящихся бактерий. Добавив к препарату в присутствии С₁₅-альдегида НАДН, можно получить высокочувствительный реактив для определения ФМН (без его предварительного восстановления):

Оксидоредуктаза Люцифераза

Н АДН + ФМН НАД⁺ + ФМНН₂ Биолюминесценция

Наоборот, если добавить к смеси люциферазы и оксидоредуктазы альдегид и ФМН, то такая смесь может использоваться как биолюминесцентная тест-система для количественного определения НАДН в биологических материалах (схема реакции такая же).

Таким образом, в настоящее время началось достаточно активное использование методов, основанных на биолюминесценции, в биохимических и клинических исследованиях. Создаются серийные приборы биолюминометры, выпускаются наборы реактивов для анализов, многие люциферазы получают методами генной инженерии.