4.1. Биохимия азотфиксации

Для фиксации молекулярного азота необходимы восстановительная сила и энергия. Энергия затрачивается на преодоление высокого активационного барьера для разрыва первой из трех чрезвычайно устойчивых при нормальной температуре связей в молекуле N≡N. В условиях промышленного синтеза NН₃ из Н₂ и N₂ (реакция Харбера-Боша) этот барьер преодолевается под действием высокой температуры и высокого давления в присутствии металлсодержащих катализаторов. Затраты АТФ и восстановителя при биологической фиксации азота настолько велики, что скорость роста бактерий и экономический коэффициент с использованием N₂ в качестве источника азота значительно ниже, чем в присутствии NН₃.

Восстановитель и молекулы АТФ синтезируются в процессе брожения, дыхания или фотосинтеза. Восстановителем в нитрогеназной реакции служит восстановленный ферредоксин (в условиях дефицита железа он заменяется флаводоксином). Восстановление ферредоксина может происходить различными путями (рис. 54). У оксигенных фототрофных цианобактерий ферредоксин восстанавливается фотосистемой I на свету и пируват:ферредоксин-оксидоредуктазой в темноте. У анаэробных хемотрофов он восстанавливается ферредоксин-зависимыми оксидоредуктазами, такими как пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза, гидрогеназа и формиатдегидрогеназа.

НСООН СО₂

2Н⁺

Н₂

Ацетил-КоА

Пируват

СО₂

Фотосистема I

НАДФН НАДФ⁺

восстановленные окисленные

хиноны, переносчики

цитохромы электронов

Нитрогеназа

Ферредоксин

Обратный транспорт электронов

Рис.54. Реакции восстановления ферредоксина как источника

водорода для нитрогеназной реакции.

У аэробных хемотрофов и аноксигенных фототрофов восстановление ферредоксина происходит при участии НАДФН и ферредоксин: НАДФ⁺-оксидоредуктаз. У аэробных хемолитоавтотрофов ферредоксин восстанавливается путем энергозависимого обратного переноса на него электронов от НАДФН.

Восстановление одной молекулы N₂ до двух молекул NН₃ описывается следующим уравнением:

N₂ + 8Н⁺ + 8ē + 16АТФ + 16Н₂О → 2NН₃ + Н₂ + 16АДФ + 16Ф_н

Данный процесс осуществляется в три последовательные стадии. Вначале N₂ превращается в диимид (НN = NН), затем в гидразин (Н₂N – NН₂) и, наконец, в NН₃:

Нитрогеназная система катализирует АТФ-зависимое восстановление не только молекулярного азота, но и ацетилена (НС ≡ СН), азида, закиси азота, цианидов, нитритов, изонитрилов и протонов.

НС ≡ СН + 2Н⁺ → Н₂С =СН₂

NН₃ + 2Н⁺ → NН₃ + N₂

НСN + 6Н⁺ → NН₃ + СН₄

N₂О + 2Н⁺ → N₂ + N₂О

Общая схема фиксации азота приведена на рисунке 55.

Для измерения нитрогеназной активности используют реакцию восстановления ацетилена до этилена, потому что этилен можно легко определить с помощью газовой хроматографии. Применение этого удобного метода позволило значительно ускорить изучение азотфиксации. Для измерения азотфиксации применяют также радиоизотопный метод, определяя включение ¹⁵N из ¹⁵N₂ в клетки бактерий с помощью масс-спектроскопии. Кроме этих методов, в качестве подхода для выявления способности к азотфиксации можно рассматривать применение генных зондов к консервативным участкам генов, ответственных за синтез нитрогеназы. Однако следует учитывать, что отрицательный результат в этом случае может быть следствием использования неподходящего зонда, тогда как положительный результат необходимо подтверждать с помощью других критериев. Вместе с тем существенным преимуществом данного подхода является то, что он позволяет выявлять гены нитрогеназы у организмов, не осуществляющих во многих условиях экспрессии.

нитрогеназа

N ≡ N

FeS

FeS

MoFe

MoFe

Н⁺; НС≡СН

Дыхание

НСN; N₂О

АТФ

NН₃

Брожение

Фотосинтез

ē → Ф_д, Ф_л

Н₂; Н₂С=СН₂

NН₃+СН₄; N₂+Н₂О ЩN₂+Н₂О ТN₂+Н₂О

N₂ + NН₃

2NH₃

Рис. 55. Общая схема фиксации азота:

Ф_д – ферредоксин; Ф_л – флаводоксин