1.1. Транспорт веществ в клетку бактерий

Различают следующие способы поступления веществ в клетку бактерий: простая, или пассивная диффузия, облегченная диффузия, активный транпорт и транслокация группы (рис. 1).

Простая, или пассивная, диффузия – неспецифическое поступление веществ в клетку за счет разницы концентраций, т.е. происходит передвижение молекул из более концентрированного раствора в менее концентрированный – по градиенту концентрации. Этот процесс не связан с затратой энергии. Таким путем осуществляется транcпорт газов, таких как О₂, N₂, CO₂, H₂ и NH₃, а также низкомолекулярных веществ (например, воды и спиртов), ядов, ингибиторов, гидрофобных (растворимых в липидах) соединений, к которым относятся алифатические (например, бутанол) и ароматические соединения (например, бензол). Для многих растворимых веществ, представляющих собой слабые кислоты или основания, способность проникать через цитоплазматическую мембрану зависит от их протонирования. Они легко проникают в клетку в незаряженной форме и гораздо труднее преодолевают барьер проницаемости в заряженной форме. Примерами таких веществ могут быть уксусная кислота (переходит через мембрану в протонированной форме) и аммоний (проникает через мембрану в депротонированной форме). Скорость перемещения веществ через мембрану путем простой диффузии невелика.

Рис. 1. Основные способы переноса веществ через мембрану в клетки бактерий: красный кружок – транспортируемый субстрат; К – белок-переносчик; К с синим прямоугольником – энергизованный белок-переносчик; ФЕП – фосфоенолпируват;

ТБ – термостабильный белок; Ф – фосфатная группа

У грамотрицательных бактерий дополнительным барьером является наружная мембрана. Она непроницаема для гидрофильных веществ, таких как углеводы, аминокислоты, белки и др. Перенос этих молекул через наружную мембрану происходит с помощью каналообразующих белков, которые представляют собой наполненные водой поры и поэтому называются поринами. С помощью поринов осуществляется пассивное проникновение растворенных веществ через наружную мембрану грамотрицательных бактерий.

Перенос веществ при облегченной диффузии (унипорте) также происходит по градиенту концентрации переносимого вещества. Этот процесс не требует затраты метаболической энергии и осуществляется с участием специальных преносчиков (транслоказ, или пермеаз). Переносчики – вещества белковой природы, локализованные в мембране и характеризующиеся высокой субстратной специфичностью, – связываясь с субстратом они подвергаются конформационным изменениям и вследствие этого приобретают способность к перемещению субстрата с одной стороны цитоплазматической мембраны на другую, где происходит его высвобождение. Таким способом происходит транспорт в клетку глюкозы у бактерий Zymomonas mobilis, лизина у бактерий Bacillus stearothermophilus, глицерола у многих бактерий, ионов аммония и др.

Активный транспорт – основной механизм избирательного переноса веществ через цитоплазматическую мембрану в клетку против градиента концентрации. Этот процесс, так же как и облегченная диффузия, протекает при участии локализованных в цитоплазматической мембране транспортных белков пермеаз. В отличие от облегченной диффузии для активного транпорта необходимы затраты энергии. Источником энергии может быть ионный потенциал или молекулы АТФ. Наиболее распространенным механизмом активного поглощения субстратов является транспорт с использованием энергии электрохимического протонного потенциала (активный транспорт первого класса), который называют термином, предложенным П. Митчеллом, – протондвижущая сила (∆р). Энергия, запасенная в виде электрохимического протонного потенциала или потенциала других ионов, например Na⁺ (система первичного транспорта), используется в системах вторичного транспорта для осуществления движения растворенных веществ против градиента их концентрации. Движущей силой вторичного транспорта служит суммарный электрохимический потенциал, соединений, участвующих в этом процессе. Системы вторичного транcпорта действуют по механизму симпорта и антипорта. При симпорте переносятся два вещества одновременно в одном направлении. Примерами симпорта является перенос протона (Н⁺) и молекулы лактозы у бактерий E.coli, перенос пролина и иона Na⁺ у бактерий E.coli, поглощение глутамата у E.coli и двух ионов натрия и др. Из этих примеров видно, что для вторичного транспорта субстратов через цитоплазматическую мембрану может использоваться как протонный, так и натриевый потенциал.

В случае антипорта два вещества транспортируются в противоположных направлениях. Принцип антипорта состоит в сопряжении двух потоков – движущего потока (происходит по градиенту концентрации субстрата) и движимого потока (происходит против градиента), таким образом, что один поток невозможен в отсутствие другого. Хорошо изучены механизмы антипорта субстрата и продукта реакции, например, антипорт малат/лактат при сбраживании малата до лактата у Lactococcus lactis, транспорт оксалат/формиат у Oxalobacter formigenes, лактоза/галактоза и аргинин/орнитин у молочнокислых бактерий, а также механизмы антипорта относительно различающихся соединений, например, фосфата и сахарофосфата у E.coli, или токсичных соединений и продуктов их детоксикации (например, антипорт катион/тетрациклин).

В системах активного транспорта второго класса перенос растворенного вещества сопряжен с синтезом или гидролизом АТФ. К этому классу относятся АТФазы, или АТФ-синтазы. АТФазы участвуют в переносе небольших одновалентных (Н⁺, К⁺, Na⁺) или двухвалентных (Са²⁺, Mg²⁺) катионов, превращая энергию фосфатной связи АТФ в электрохимический градиент переносимого иона или наоборот – энергию градиента в энергию АТФ, как и в случае АТФ-синтаз, сопряженных с дыхательной цепью.

Ко второму классу транспортных систем относится также транспорт веществ, зависимый от периплазматических субстрат-связывающих белков. Этот транспорт связан с гидролизом АТФ и присутствует в основном у грамотрицательных бактерий. У бактерий E.coli обнаружено более 20 таких транспортных систем. Они переносят разнообразные субстраты, включая аминокислоты, пептиды, моносахариды, дисахариды, органические анионы, нуклеотиды, коферменты, неорганические ионы, такие как сульфат или фосфат. Хорошо изучены системы поглощения мальтозы, гистидина и олигопептидов у E.coli и Salmonella typhimurium. Как правило, молекулы белков-переносчиков пермеаз в этих системах состоят из четырех субъединиц, или доменов (рис. 2.). Две субъединицы высокогидрофобны и погружены в мембрану, а две другие лишь соединены с ней с цитоплазматической стороны. Отличительная особенность этих систем состоит в том, что молекулу субстрата должен транспортировать к пермеазам дополнительный водорастворимый субстратсвязывающий белок, локализованный в периплазматическом пространстве. На рисунке 2 показан механизм транспорта мальтозы у бактерий E.coli.

Цитоплазма

Рис. 2. Система поглощения мальтозы, зависящая от субстратсвязывающих белков у E.coli. Обозначения субъединиц: В – LamB; Е – MalE; F – MalF; G – MalG;

К – MalK. S – субстрат

Мальтоза проникает в периплазматическое пространство через специфичный к этому углеводу порин Lam B и прочно связывается с субстратсвязывающим белком MalE. В результате связывания конформация этого белка изменяется. При взаимодействии комплекса белок MalE-субстрат с расположенными в мембране субъединицами MalF и MalG пермеазы происходит высвобождение субстрата и перенос его в цитоплазму. Этот процесс сопряжен с гидролизом АТФ, который осуществляют мембраносвязанные субъединицы пермеазы MalK.

Системы поглощения субстратов, зависящие от периплазматических субстрат-связывающих белков, характеризуются однонаправленностью транспорта. Они обладают высоким сродством к субстрату и отличаются относительно низкой максимальной скоростью транспорта.

Таким образом, транспортные системы, связанные с водорастворимыми субстратсвязывающими белками образуют обширное суперсемейство. Для переносчиков во всех этих системах характерно наличие общих аминокислотных последовательностей, образующих участок связывания АТФ. Поэтому этот класс транпортных АТФаз назван семейством АВС-переносчиков (от АТР-binding cassette). Белки АВС-пере-носчики сходны по аминокислотной последовательности и структурной организации. Они участвуют во многих физиологических процессах, таких как поглощение растворенных веществ, выведение антибиотиков, гемолизинов, полисахаридов и различных токсинов.

К третьему классу активного транспорта относятся специфические транспортные системы, которые осуществляют выделение их клеток ионов натрия, сопряженное с декарбоксилированием. Эти системы открыты у бактерий Propionigenium modestum, Klebsiеlla pneumoniae и Salmonella typhimurium. Декарбоксилированию подвергаются карбоновые кислоты, например оксалоацетат или метилмалонил-КоА. Процесс катализирует мембраносвязанная, биотинзависимая декарбоксилаза.

При транслокации группы происходит химическая модификация переносимых молекул, тогда как при пассивной диффузии, облегченной диффузии и активном транспорте они поступают в клетку в химически неизмененном виде. Так происходит поступление в клетку многих прокариот углеводов, в процессе которого они фосфорилируются. Источником фосфатной группы служит фосфоенолпируват, от которого фосфат с помощью фермента (фермента I), находящегося в цитоплазме, переносится на молекулу специального термостабильного белка (ТБ), а с него, при участии второго фермента (фермента II), локализованного в цитоплазматической мембране и обнаруживающего высокое сродство к определенным углеводам, фосфатная группа переносится на углевод на наружной стороне цитоплазматической мембраны:

Фермент I Ф осфоенолпируват + ТБ пируват + ТБ-Ф, Фермент II Т Б-Ф + углевод углевод-Ф + ТБ.

Фосфорилированные углеводы проникают через цитоплазматическую мембрану и накапливаются в цитоплазме, например, глюкоза поступает в клетку в виде глюкозо-6-фосфата. Система переноса углеводов получила название фосфотрансферазной. Перенос веществ с помощью фосфотрансферазной системы является выгодным с энергетической точки зрения. Хотя при этом и происходит затрата богатой энергией фосфатной связи фосфоенолпирувата, в процессе переноса образуется молекула глюкозы в фосфорилированной форме (глюкозо-6-фосфат), а это делает ненужным фосфорилирование глюкозы за счет АТФ на первом этапе ее катаболизма.