Тема 4. Природа, властивості та класифікація ферментів

План

1. Характеристика ферментів.

2. Властивості ферментів.

3. Будова ферментів.

4. Механізм дії ферментів

5. Активність ферментів.

6. Класифікація ферментів.

1. Характеристика ферментів

Ферменти - це органічні речовини білкової природи, які утворюються в живих організмах і мають здатність прискорювати перебіг хімічних реакцій в організмі. Саме існування життя зумовлене наявністю білків з ферментативними функціями, а обмін речовин в кожній клітині визначається повним набором ферментів. Від інших каталізаторів ферменти

відрізняються тим, що в природі вони зустрічаються лише в живих організмах, мають високу специфічність і каталітичну дію Крім того, всі хімічні реакції, які відбуваються за участю ферментів, проходять при нормальному тиску, температурі, близькій до кімнатної, при слабко-кислій, нейтральній або слабко-лужній (у більшості випадків) реакції середовища і т. д. Для ферментів характерним є те, що синтез їх та каталітична активність контролюється на генетичному рівні, а також за участю цілого ряду низькомолекулярних сполук - субстратів або продуктів реакції.

2. Властивості ферментів

1. Ферменти - є білковими речовинами, для яких характерна висока молекулярна маса - від десятків тисяч до мільйонів дальтон.

2. Ферменти - утворюють колоїдні розчини і не проходять через напівпроникні мембрани.

3. Ферменти - амфотерні електроліти.

4. Ферменти - висолюються нейтральними солями.

5. Ферменти - інактивуються при нагріванні >50°С.

6. Ферментам - властива специфічність дії.

7. Ферменти - оптимум рН.

8 . Активність ферментів залежить від компонентів клітини - одні активують, інші паралізують (інгібітори).

9. Виділяються у неактивній формі, а потім стають активними.

10. Ферментам властива оборотна дія (як пряма, так і зворотна).

3. Будова ферментів

Ферменти бувають прості і складні.

Прості ферменти - представленні одним або кількома поліпептидними ланцюгами і при гідролізі розщеплюються до амінокислот Більшість простих ферментів каталізують гідролітичні процеси (пепсин, трепсин та ін.) Активним центром є комбінація залишків амінокислот, які розміщені на відповідній ділянці молекули ферменту. Як правило це цистеїн, серин, аргінін та ін. (SН-, ОН-, СООН- та ін.).

Складні ферменти - крім білкової частини містять групу небілкової природи - кофактор - їх роль виконують деякі вітаміни (В₁, В₂, РР) та їх похідні, окремі фосфорні ефіри моносахаридів, нуклеотиди, металовмісні комплекси, атоми Fе, Сu, Мg тощо.

Усі кофактори поділяють на коферменти, простетичні групи активатори.

Коферменти зв'язані з білковою частиною ферменту слабкими електростатичними або вандервальсівськими силами. З'єднання коферментів з білковою частиною підвищує його стійкість до різних зовнішніх факторів. Коферменти у ферментопротеїдах виконують роль переносників різних функціональних груп, атомів, електронів і протонів (НАД, НАД Ф, НS -коА).

Простетичні групи - з апоферментами зв'язані ковалентними зв’язками. Молекули таких ферментів дисоціюють слабко або не дисоціюють зовсім. (ФАД, ТПФ, гемінові тощо). Беруть участь в окислювально-відновних реакціях клітинного дихання, декарбоксилювання.

Активатори ферментів - прискорюють реакції, що каталізуються ферментами. Активаторами є іони металу – Мn, Zn, Сo та ін. Підкреслимо, що білкова і небілкова частини ферментів окремо ферментативної активності не виявляють. Така активність спостерігається тільки тоді, коли білкова частина з'єднана з небілковою. Кофактор підвищує стійкість білкової частини, а остання зумовлює специфічність каталітичної дії ферментів. Небілкова частина, приєднуючись до різних білків, може каталізувати зовсім інші процеси.

Активний центр ферменту - визначає специфічність і каталітичну активність ферменту, складається із складних структур, які можуть зближуватись і взаємодіяти з молекулою субстрату S. Активний центр ферменту складається із функціональних груп, які відповідно зорієнтовані у просторі. Порушення третинної і вторинної структур призводять до зниження або повної втрати активності Ф.(наприклад, при температура → денатурація → інактивація).

Деякі ферменти мають два і більше активних центрів. В активному центрі відрізняють так звану каталітичну ділянку, яка безпосередньо взаємодіє з субстратом, і контактну (якірну) ділянку (площадку), яка зумовлює спорідненість до субстрату і формування його комплексу з Фермента.

Такий поділ активного центру ферменту є досить умовним, оскільки взаємодія в контактній ділянці ферментативних субстратних сполук значною мірою впливає на швидкість перетворень, які відбуваються на каталітичній ділянці фермента. Умовний характер має також і саме виділення активного центру від інших частин ферменту, оскільки вони мають важливе значення в утворенні його нативної структури і впливають на реакційну здатність функціональних груп активного центру Отже, за каталітичну активність фермента відповідає вся структура його молекули.

Крім активного центру в молекулі фермента може бути також алостеричний центр (від грец. алос - другий, інший; стереос - просторовий структурний). Алостеричний центр - це ділянка молекули фермента, яка в результаті приєднання до неї низькомолекулярної сполуки зумовлює зміну просторової (третичної), а іноді і четвертинної структури фермента. Це, в свою чергу, призводить до зміни конфігурації активного центру, що зумовлює зміну каталітичної активності. Цей процес є основою так званої алостеричної регуляції ферментативної активності. Такі алостеричні ферменти мають декілька активних і алостеричних центрів. Функціональна активність цих центрів тісно взаємопов'язана між собою і структурою усієї молекули ферменту.

4. Механізм дії ферментів

Ферменти - значно знижують енергію активації тих чи інших реакцій, тобто енергію, яка необхідна для активації молекул реагуючих речовин, щоб відбувалася відповідна реакція.

Механізм дії ферментів у процесах каталізу тих чи інших реакцій пов'язані з утворенням фермент-субстратних комплексів. За цих умов фермент змінює молекулу субстрату так, що енергія, яку необхідно прикласти для переведення її в активний стан, значно зменшується.

Про взаємодії ферменту з субстратом між ними можуть утворюватися різні типи зв'язків: іонні, водневі і гідрофобні. Зв’язування ферменту з субстратов здійснюється в основному через активний центр, який, як правило, розміщений на поверхні глобул в їх заглибленнях, впадинах щілинах. Це зумовлює більш міцне і надійне зв'язування фермента з субстратом і підвищує специфічність їх взаємодії. Тут має місце висока відповідність між ферментом і субстратом по типу "Замок - ключ''. Німецкий біохімік Е. Фішер передбачив, що ферменти підходять до свого субстрату як ключ до замка і що фермент має жорстку структуру і якщо "ключ" трохи видозмінено, то він уже не підійде до свого "замка". Але американський вчений Д. Кошленд вважає, що конформація молекули ферменту і його активного центру може зміщуватися під дією субстрату і кофермента.

Приєднання субстрату або коферменту до ферменту змінює структуру активного центру і його функціональні групи розміщуються так, що може відбуватися реакція.

Під час каталітичного процесу утворення фермент-субстратного комплексу відбувається поетапно. На першому етапі ферментативного каталізу субстрат з'єднується з ферментом, на другому відбувається активація і видозмінення субстрату з утворенням одного або декількох активних комплексів і на останньому (третьому) етапі - відділення продуктів реакції від фермента.

Рис. 3. Схема дії ферментів

Схематично ці етапи можна записати так:

E = S → ES → E + P₁ + P₂,

Де Е - ензім (фермент); S - субстрат; ЕS - первинний фермент-суубстратний комплекс; ЕS – активований фермент-субстратний комплекс; P₁ і P₂ – продукт 1 і 2.

Слід відзначити, що найшвидше реакція відбувається на першому етапі. Низька енергія активації свідчить про те, що в первинному комплексі фермент і субстрат зв'язуються за рахунок слабких типів зв'язку. На другому етапі перетворення молекули субстрату відбувається з розривом і утворенням ковалентних зв'язків. На цьому етапі фермент змінює молекулу субстрату так, що міцність окремих хімічних зв'язків зменшується, в результаті чого знижується енергія активації і реакція відбувається з великою швидкістю.

Отже, фермент знижує бар’єр активації реакції, яку він каталізує, ділячи її на ряд проміжних етапів, кожний з яких не зустрічає енергетичних перешкод. Основна роль в механізмі ферментативного каталізу належить фермент-субстратним комплексам.

Ізоферменти. Цілий ряд ферментів має четвертинну структуру, тобто побудовані з двох, чотирьох і більшої кількості субодиниць. При цьому субодиниці бувають двох різних типів. Такі субодиниці, з'єднуючись між собою в різних співвідношеннях, утворюють декілька форм одного і того ж ферменту, тобто ізоферменти. Вони мають однакову субстратну специфічність і однаковий механізм каталітичної дії. Ізоферменти відрізняються між собою окремими фізико-хімічними та імунологічними властивостями, каталітичною активністю.

Залежно від віку, фізіологічного стану та інших факторів в організмі встановлюється певне співвідношення між різними ізоферментами, якому відповідає певний рівень активності ферменту в цілому. Зміна співвідношення ізоферментів в організмі має важливе значення в регуляції їх активності та адаптації організму до зміни навколишнього середовища.

5. Активність ферментів

Характерною особливістю дії ферментів є їх висока каталітична активність. Вона значно вища, ніж неорганічних каталізаторів.

Активність ферментів характеризується швидкістю хімічних реакцій, які вони каталізують, їх визначають по кількості субстрату, який перетворюється за одиницю часу, або по кількості продуктів реакції, які утворюються за цей час. Активність ферменту визначають також, виходячи із залежності, яка при певних умовах існує між активністю ферменту і його концентрацією.

Активність фермента виражають в одиницях, які називаються каталами (скорочено кат). Катал - це каталітична активність, яка здійснює хімічне перетворення 1 моль субстнату за 1 с, це дуже висока активність, тому використовують 0,001 або 1/10^-6 частку цієї одиниці. Молекулярна активність - це кількість молекул субстрату, яка перетворюється за одну хвилину однією молекулою фермента. Для різних ферментів молекулярна активність також різна - її називають ще числом обертів ферменту.

Вплив температури на активність ферментів. Ферменти термостабільні речовини. Зміна температури зумовлює зміну їх активності. Так, підвищення температури на 10°С прискорює швидкість хімічних реакцій приблизно в 2 рази. Але ферменти є білками і підвищення їх каталітичної активності відбувається до того часу, поки не почнеться денатурація білка Денатурація фермента викликає руйнування його нативної структури, а це в свою чергу, зумовлює втрату ферментативної активності.

20 40 60 80 100

Рис. 4. Залежність активності ферментів від температури.

Як слідує з графіка, при порівняно низькій температурі - нагрівання помітно прискорює активність ферментів, а при тривалому нагріванні відбувається його денатурація і швидкість реакції різко зменшується. При t⁰=90-100⁰С ферменти майже повністю втрачають свою каталітичну активність. Температура, при який фермент має максимальну активність називається оптимальною температурою ферментів. Для більшості ферментів людини t⁰=37-45°С - оптимальна.

Стійкість ферментів до нагрівання залежить від умов середовища: рН, наявності розчину солей, кількість ферментів в розчині, ступінь очистки ферментів і таке інше. Але є ряд ферментів які витримують нагрівання майже до 100°С.

При зниженні температури, порівняно з оптимальною, активність ферментів зменшується, а при t⁰ < 0°С вона повністю втрачається, але так як структура ферментів не руйнується, тому при підвищенні температури ферменти повністю відновлюють свою активність.

Вплив рН середовища на активність ферментів. Активність ферментів досить чутлива до кислотності середовища. Більшість ферментів організму людини найбільш активна в досить вузьких межах концентрації водневих іонів (рН). Для кожного ферменту характерний свій рН, при якому його активність максимальна. Зниження або підвищення рН відносно оптимального зумовлює зниження активності ферментів. Вплив рН на активність ферментів пов'язаний з їх впливом на активний центр ферментів. Залежно від рН середовища активний центр ферментів може бути в різній мірі іонізований, що впливає на формування активного фермент-субстратного комплексу. Крім того, рН впливає на іонізацію субстрату і кофакторів, що також впливає на каталітичну активність ферментів.

Спецефічність дії ферментів - зумовлена конфігурацією і електростатичною комплементарністю між молекулами ферменту і субстрату та структурою активного центру фермента, який забезпечує високу спорідненість ферменту до відповідного субстрату.

Під специфічністю дії ферментів розуміють відповідну спрямованість їх впливу на певний субстрат, групу субстратів, близьких за своїми властивостями, або певний тип зв'язку. Залежно від цього розрізняють абсолютну, відносну та просторову (стереоізомерну) специфічність ферментів.

Абсолютна специфічність - ферменти, які каталізують лише одну реакцію і діють на один точно визначений субстрат.

Групова специфічність - ферменти, які діють на різні субстрати, що мають однаковий тип зв'язку, інакше, це специфічність ферментів по відношенню до певного типу реакції.

Стеріоізомерна ( просторова) специфічність ферментів - коли вони діють на оптично активні сполуки, або сполуки, для яких характерна цис- і транс-ізомерія.

Активатори і інгібітори ферментів. Речовини, які підвищують активність ферментів - активатори, а ті, що знижують, - інгібітори. Активаторами є різні сполуки - мінеральні солі і кислоти, органічні речовини, ферменти, іони металів і т. д.(останні можуть виступати як складові компоненти активного центру ферментів, сприяти утворенню фермент-субстратних комплексів).

Інгібітори викликають гальмування ферментативних процесів. Гальмування може бути оборотним і необоротним.

При конкурентному гальмуванні - інгібітор має структуру подібну субстрату, тому між ними виникає конкуренція за взаємодію з ферментом (оборотне).

При неконкурентному гальмуванні інгібітор взаємодіє з важливими функціональними групами ферментів (алостеричний центр), що змінює структуру фермента (необоротне).

4. Класифікація ферментів

У 1898 р. Дюкло запропонував давати назву ферментам відповідно до назви субстрату, на який вони діють, з додаванням суфікса -аза: сахараза лактаза, амілаза, ліпаза і т. д.

У 1961 р. на генеральній асамблеї Міжнародної біохімічної спілки у Москві схвалено нову класифікацію - 6 класів, а в них підкласи ферментів, в залежності від субстрату та природи хімічної реакції, яку він каталізує.

1. Оксидоредуктази - каталізують окислювально-відновні процеси, що відбуваються у живих клітинах.

2. Трансферази - прискорюють реакції перенесення окремих атомів і груп атомів від одних субстратів до інших.

3. Гідролази - каталізують реакції розщеплення органічних сполук за участю води.

4. Ліази - каталізують процеси відщеплення яких-небудь груп негідролітичним шляхом з утворенням подвійного зв'язку, або навпаки приєднання відповідних груп атомів по місцю подвійного зв'язку.

5. Ізомерази - прискорюють процеси ізомеризації органічних сполук.

6). Лігази (синтетази) - каталізують синтез складних органічних сполук з більш простих за рахунок енергії розщеплення АТФ та інших трифосфатнуклеотидів.